DCP快速分离检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种DCP快速分离检测试剂盒。通过本发明专利技术能快速、准确地体外定量测定人血清样本中异常凝血酶原(DCP)的含量，临床上主要用于对原发性肝细胞癌(HCC)与慢性肝病及良性肝占位性病变的鉴别诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗器械及体外诊断细分领域。具体地，本专利技术涉及一种DCP快速分离检测试剂盒，和一种优选用于异常凝血酶原(DCP)快速分离检测试剂盒制备的单克隆抗体及其杂交瘤细胞。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是一种世界范围内常见的恶性肿瘤疾病，其发病率逐年上升，目前已跃居全球所有肿瘤发病率的第四位。HCC的死亡率较高，居全球癌症死因的第三位，全球每年大约有25万名患者死于肝癌细胞。HCC发病机制至今仍不清楚，缺少有效地早期诊断技术及方法是HCC死亡率高的重要原因。因此，早期发现和早期治疗是HCC患者生存的关键，报道显示早期阶段发现HCC，并采取有效治疗，其五年生存率可提高至50％。HCC可由多种因素诱发，如肝炎、肝硬化、致癌物质以及环境因素等，HCC恶性程度较高且易于复发、转移，但其早期诊断较为困难，容易耽误最佳治疗时期，因此一个高灵敏的HCC检测系统的研究是必要的。凝血酶原(prothrombin)是凝血酶的前体，它由肝脏合成，参与凝血调控。正常的凝血酶原是由维生素K依赖的γ赖谷氨酰基羧化酶将位于N末端附近的10个谷氨酸(Glu)残基羧化形成γ形羧基谷氨酸(Gla)，从而使其具有正常的生理功能。在维生素K缺乏、γ乏谷氨酰基羧化酶功能异常，或肝功能受损等情况时，10个谷氨酸不能够被完全羧化，因此形成了脱-谷氨羧基凝血酶原(des-酶原carboxyprothrombin，DCP)，也称为维生素K缺乏诱导的蛋白-II(ProteininducedbyvitaminKabsence-II，PIVKA-II)。羧化能力不足会导致10个Gla残基中的全部或一部分形成Glu残基，任何一个或多个位点谷氨酸残基羧化不全，都将产生脱-基，羧基凝血酶原(DCP)。1984年Liebman等首次报道约90％的HCC患者血清DCP升高，从此DCP作为HCC的血清肿瘤标志物得到了广泛的研究与证实，且肝脏细胞分泌的DCP肝硬化、慢性肝炎等影响。目前，DCP已被公认为HCC有用的肿瘤标志物，并逐渐被应用于临床。目前文献报道及实际应用检测的主要方法有：酶联免疫法(ELISA)、免疫沉淀法、液相亲和免疫法、电化学发光法、Westernblot方法等。Wako公司开发的DCP定量检测试剂盒采用复杂的色谱分离技术，Eilsai公司研发电化学免疫分析法检测人血清内DCP含量，Wako和Eilsai公司研制的DCP检测试剂盒均需应用到复杂的仪器设备，且仪器试剂价格昂贵，不利于推广应用。ELISA方法不需要复杂的仪器设备，但其具有需要纯手工操作，人为干扰因素较大，时间长，灵敏度低及线性范围小等缺点。专利CN104949971B公开一种肝癌早期诊断试剂盒及其应用，该方法为标准ELISA方法，其检测灵敏度为2mAU/ml，线性范围未做明确记载，按照其实施例推算为10-2000mAU/ml；其检测灵敏度偏低，线性范围小，检测时间长，手工操作，使临床应用受到较大限制。专利CN101377505A公开一种DCP微孔板化学发光法免疫分析测定试剂盒及其制备方法，该方法实质上为ELISA检测的一种，且其测定单位为mAU/ml,mAU为酶活性单位，是一种非国际或国内标准单位，每个研究者由于使用抗体不同，酶活性单位定义也不同，因此使得DCP检测结果的溯源性较差，无法获得相对一致的检测结果，另外该方法的检测线性为4.37-2000mAU/ml；其检测灵敏度偏低，线性范围小，检测时间长，手工操作，使临床应用受到很大限制。专利CN104520710A公开一种PIVKA-II测定方法、测定试剂盒，该方法主要是对人血清、血浆检测DCP结果进行一致性研究，而在临床应用的实际检测应用中，单独采集一种血液类型检测血清或血浆即满足临床需求，同时检定血清、血浆的DCP含量，需要对患者进行两种不同形式的血液采集，如采用EDTA抗凝采血管、非抗凝采血管同时采集，加重了患者的身体和经济的双重负担，且在临床操作中无实际意义；另外该方法依然采用mAU/ml作为检测单位，不利于检测的溯源性及对比性，且该专利对DCP的检测的灵敏度和线性范围的改进无任何记载；另外该专利采用抗凝血酶原单抗混合物及抗DCP单抗分别作为标记和包被，其中重点包括抗凝血酶原的制备，而对抗DCP单克隆抗体的制备，尤其是覆盖更全面的抗原表位的抗DCP单克隆抗体缺少必要的表述，但抗DCP单克隆抗体的表位的覆盖对DCP检测的灵敏度、特异性有着非常重要的作用。高灵敏度DCP的检测依赖于高灵敏度、高特异性的抗DCP单克隆抗体。根据已有研究报道，不同病人体内DCP的羧化顺序不同，因此不同病人身体内的DCP种类和含量也各不相同，理论上，有多少种Glu存在形式就有多少种DCP蛋白。由于DCP的抗原性依赖其氨基酸残端10个谷氨酸的转化程度及其谷氨酸区的构象，因此识别不同DCP表位的抗体特异性和灵敏度尤为重要。目前的研究中，已经有一些不同的诊断HCC的单克隆抗体，例如MU3和3C10，但由于单克隆抗体的识别表位有限，不能够将所有DCP捕获，因此检测灵敏度较低。
技术实现思路
为了解决现有技术问题的不足，本专利技术提供了一种DCP快速分离检测试剂盒，并提供了一种可用于制备DCP快速分离检测试剂盒的高灵敏度抗DCP单克隆抗体及组合物。本专利技术的一方面，提供一种DCP快速分离检测试剂盒，主要组成成分包括：包被抗体、标记抗体、清洗液、底物液、定标液1、定标液2和定标稀释液。在本专利技术的一个优选的实验方案中，包被抗体为经磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体，标记抗体为酶标记的抗凝血酶原单克隆抗体；或者包被抗体为经磁珠偶联的抗凝血酶原单克隆抗体，标记抗体为酶标记的抗DCP单克隆抗体；其特征在于：包被抗体、标记抗体共同与待测样品中的DCP在液相中形成免疫夹心复合物，通过经定标液标定的标准曲线准确测定样品中DCP的含量。在本专利技术的一个更优选的实验方案中，抗DCP单克隆抗体为一种单克隆抗体或两种及以上单克隆抗体的组合物，其特征在于抗DCP单克隆抗体及组合物的抗原表位为不同类型的DCP抗原及DCP抗原的不同表位，至少对应SEQIDNO:3-22所示的氨基酸序列中的两种以上，其中SEQIDNO:2-22所示的氨基酸序列如下：SEQIDNO2：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCSTEEAFEALESSTATDVFSEQIDNO3：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγγTCSYγγAFγALγSSTATDVFSEQIDNO4：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCSSEQIDNO5：ANTFLEγVRKGNLγRECVγγTCSSEQIDNO6：ANTFLEEVRKGNLγRγCVγγTCSSEQIDNO7：ANTFLEEVRKGNLERγCVγγTCSSEQIDNO8：ANTFLEEVRKGNLERECVγγTCSSEQIDNO9：ANTFLEEVRKGNLERECVEγTCSSEQIDNO10：ANTFLEEVRKGNLERγCVEγTCSSEQIDNO11：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγETCSSEQIDNO12：ANTFLγγVRKGNLγRγCVEETCSSEQIDNO13：ANTFLγ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DCP快速分离检测试剂盒，其包括：包被抗体、标记抗体、清洗液、底物液、定标液1、定标液2和定标稀释液。

【技术特征摘要】
1.一种DCP快速分离检测试剂盒，其包括：包被抗体、标记抗体、清洗液、底物液、定标液1、定标液2和定标稀释液。2.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述包被抗体、所述标记抗体共同与待测样品中的DCP在液相中形成免疫夹心复合物，通过经定标液标定的标准曲线测定样品中DCP的含量；且所述包被抗体为经磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体，和所述标记抗体为酶标记的抗凝血酶原单克隆抗体；或者所述包被抗体为经磁珠偶联的抗凝血酶原单克隆抗体，和所述标记抗体为酶标记的抗DCP单克隆抗体。3.如权利要求2所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述抗DCP单克隆抗体为一种单克隆抗体或两种以上单克隆抗体的组合物，且所述抗DCP单克隆抗体及组合物的抗原表位为不同类型的DCP抗原或者DCP抗原的不同表位，所述表位至少对应SEQIDNO:2-22所示的氨基酸序列中的两种以上。4.如权利要求3所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述抗DCP单克隆抗体及组合物为由杂交瘤细胞4D09和/或3H08生产的抗DCP单克隆抗体；所述杂交瘤细胞4D09和3H08已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCCNo.10211和CGMCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：高琦，李伯安，乔雍，郄霜，马海雪，刘飞，李辉，李艳召，余韶华，
申请(专利权)人：北京热景生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11