鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。本发明专利技术首先分离了一株鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。本发明专利技术进一步公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)培养鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。本发明专利技术分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养；免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高并且节约生产成本等优点。

【技术实现步骤摘要】
鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用
本专利技术涉及鹅副黏病毒，尤其涉及一株分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株，本专利技术还涉及所述分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株在制备预防鹅副黏病毒病的疫苗中的用途，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。
技术介绍
鹅副黏病毒(Gooseparamyxovirus,GPMV)是副黏病毒科，副黏病毒亚科，腮腺炎病毒属。鹅副黏病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病，一年四季均可发生，发病率为40％-100％，平均为60％左右，死亡率为30％-100％，平均为40％左右。不同日龄的鹅均易感染，但日龄越小发病率和死亡率越高，其中15日龄以内雏鹅的发病率和死亡率可高达100％。随鹅群日龄的增长，发病率和死亡率也随之下降，部分病鹅可逐渐康复。种鹅感染发病后，除死亡外，产蛋量大大下降，受精率也很低。目前，部分养殖户用新城疫疫苗免疫鹅，以预防鹅副黏病毒。根据报道，新城疫病毒一般不感染鹅，即使感染也不发病(Gagicetal,1999)。任涛等(2000)曾用国内NDV标准强毒株F48E8攻击28日龄的鹅，发现NDV强毒株对鹅的发病率和死亡率均为0。鹅副黏病毒病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法是疫苗的接种。目前，市售的鹅副黏病毒疫苗绝大多数为鸡胚生产的组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差较大等缺点。因此，分离一株鹅副黏病毒细胞适应毒株，对于降低鹅副黏病毒疫苗的生产成本、稳定产品质量具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一株鹅副黏病毒(Gooseparamyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性，免疫原性良好，产生抗体效价高，且降低疫苗生产成本。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先分离了一株鹅副黏病毒株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性；在此基础上，本专利技术进一步驯化分离出了一株细胞适应毒，命名为DQ03株。本专利技术将分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9901；分类命名是：鹅副黏病毒；保藏时间是：2014年10月22日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术从黑龙江省大庆市郊某养殖场无菌采集病死鹅的肝脏、脾脏等组织中分离出一株鹅副黏病毒。分离病毒能被ND阳性血清所抑制，HI效为28；不能被EDS76阳性血清、H5和H9禽流感阳性血清所抑制。分离毒株的EID50为108.17/0.1ml，脑内致病指数(ICPI)为0.16，鸡胚平均致死时间(MDT)为114h，表明本专利技术分离的鹅副黏病毒毒株为低毒力病毒。本专利技术将分离毒株接种在生长良好的鸡胚成纤维细胞(CEF)上，36h后开始出现典型的细胞病变，病变初期表现为细胞聚缩，之后，合胞体数量逐渐增多、变大；60h时75％CEF出现细胞病变，细胞逐渐脱落，细胞之间的空白区逐渐增大，残留的细胞呈拉网状结构；当细胞病变达70％时，测定细胞液的HA效价为1∶512。表明，分离毒株具有CEF细胞适应株的特性。本专利技术将分离病毒进行蚀斑纯化，挑选中等大小的5个蚀斑进行传代纯化，分离得到5个病毒株，分别命名为DQ01株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株。分离到的5个病毒株(DQ01～DQ05株)的HA及TCID50检测结果表明，病毒DQ03株性能最优，其对鸡胚成纤维细胞高度适应，HA效价达1：1024，TCID50达109.38TCID50/0.1ml，显著高于其他分离毒株。本专利技术分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株能够应用于制备预防鹅副黏病毒病的疫苗。本专利技术进一步公开了一种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，包括：免疫有效量的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。本专利技术还公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)培养所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。其中，步骤(1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞培养或者经SPF鸡胚培养；优选为，经鸡胚成纤维细胞培养。步骤(2)所述灭活是向病毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃灭活24小时。步骤(3)所述离心是5000r/min离心30min；所述病毒上清液与佐剂按照体积比1：1.5混合；所述佐剂优选为进口油佐剂。本专利技术所述方法制备得到的鹅副黏病毒灭活疫苗，能够有效预防鹅副粘病毒。本专利技术将分离的鹅副黏病毒DQ01-DQ05株分别制备油乳剂灭活疫苗；经鸡胚成纤维细胞培养，病毒液半成品的HA及TCID50测定结果表明，DQ03株HA效价达1：1024，TCID50达109.38TCID50/0.1ml，高于鸡胚扩增的原始病毒液及其他分离株。动物免疫保护试验结果表明，分离的鹅副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同时间抗体效价均高于其他实验组，免疫后21天HI抗体效价达8.5log2；与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并且节约生产成本等优点。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养；免疫保护试验表明，分离的鹅副粘病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并且节约生产成本、产品质量稳定等优点。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语“分离的”意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分(例如细胞质或膜组分)。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。附图说明图1为分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖；其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株分离的鹅副黏病毒(Goose paramyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。

【技术特征摘要】
1.一株分离的鹅副黏病毒(Gooseparamyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.9901。2.权利要求1所述的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株在制备预防鹅副黏病毒病的疫苗中的用途。3.一种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。4.一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养权利要求1所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙德君，丁国杰，杨万秋，梁宛楠，李来旭，宋扬，藏玉婷，刘鑫莹，张智明，李鑫，窦海艳，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23