鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法。包括：(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体。根据本发明专利技术的抗体免疫攻毒试验结果可见，本发明专利技术抗体可安全、有效的预防新型鸭呼肠孤病毒引起的以肝脏不规则坏死、脾脏坏死为特征性病变的鸭新型鸭呼肠孤病和鸭肝炎病毒引起的以肝脏肿胀和出血为主要病理变化的鸭病毒性肝炎，能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病。

【技术实现步骤摘要】
鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
本专利技术涉及鸭疫病卵黄抗体，尤其涉及鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法，属于鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体领域。
技术介绍
新型鸭呼肠孤病毒病是中国近年来新出现的,以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病,俗称"鸭新肝病"、"鸭坏死性肝炎病"等。该病番鸭、半番鸭、麻鸭和北京鸭等各品种的鸭均可发病，该病无明显季节性，发病鸭一般为3～25日龄，鸭的日龄愈小，发病率和死亡率愈高。NDRV的感染严重损害鸭免疫器官，造成免疫抑制，导致其他传染病的继发。该病最先于2005年在中国的福建、浙江和广东等地鸭群中出现和流行，后蔓延至全国。鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。鸭肝炎病毒有3个血清型，我国主要流行血清1型和3型鸭病毒性肝炎。本病主要发生于4～20日龄雏鸭，成年鸭有抵抗力，鸡和鸭不能自然发病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使本病发生。本病发生于孵化雏鸭的季节，一旦发生，在雏鸭群中传播很快，发病率可达100％。目前对于这两种疫病只能采用单独的疫苗进行防控，存在多次接种免疫导致出现不良反应，不方便、防治成本高等问题，由此尽快研制出一种安全有效的能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病的卵黄抗体尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病的鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术提供了一种鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体，其制备方法包括：(1)分别制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化制备得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得。步骤(1)所述的鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将鸭呼肠孤病毒疫苗株接种鸡肝癌细胞(LMH)，培养后收获细胞液，即得；其中，所述的鸭呼肠孤病毒疫苗株可以是任何一种能够通过商业途径购买或自行分离得到的鸭呼肠孤病毒疫苗株，作为本专利技术的一种具体的实施方式，本专利技术采用了新型鸭呼肠孤病毒疫苗S株，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20000；步骤(1)中所述的鸭肝炎病毒液抗原的制备方法包括，将鸭肝炎病毒疫苗株接种鸭胚，培养后收获尿囊液；作为本专利技术的一种具体的实施方式，本专利技术将1型鸭甲型肝炎病毒JS株和3型鸭甲型肝炎病毒SD株分别接种易感鸭胚，培养后收获尿囊液；其中，所述新型鸭呼肠孤病毒S株是1型鸭甲型肝炎病毒JS株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.6852；所述3型鸭甲型肝炎病毒SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.8560。作为本专利技术一种具体的实施方式，步骤(2)中所述的制备鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗的方法包括，(a)油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却，即得；优选的，将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；(b)水相制备：将灭活后的3种病毒抗原混合均匀后再与吐温-80混合，吐温-80完全溶解混匀均匀；优选的，将检验合格的3种病毒液按1:1:1的比例混合，再将混合液与吐温-80按95:5的比例混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；(c)乳化：将油相和水相混合乳化，即得；优选的，将油相和水相以1:2比例乳化30min。步骤(3)中所述的用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序优选为：(a)基础免疫：鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.5ml；(b)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(c)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(d)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。步骤(3)中所述的收集高免蛋的方法优选为：产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免蛋鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价均不低于1:1024时，收集高免蛋。步骤(4)中所述的提取卵黄抗体方法可以是各种常规的卵黄抗体方法,包但不限于Tritionx-100法、浓盐水法、聚乙二醇方法、氯仿法、苯酚法或酸化水-辛酸法等,本专利技术根据提取方法的比较试验结果发现，选用Tritionx-100法提取的卵黄抗体回收率、纯度、澄清度、除脂率和抗体效价均显著优于浓盐水法、氯仿法、聚乙二醇法、苯酚法及酸化水-辛酸法。作为本专利技术的一种优选的具体实施方式，Tritionx-100法提取的卵黄抗体的方法包括：(a)蛋壳消毒后蛋黄分离，收集卵黄；(b)除脂：将卵黄和PBS缓冲液混匀，静置；(c)萃取：吸取并量取上清液体积加入6％Tritionx-100，搅拌，升温后放置，取下层液体；(d)过滤、浓缩：将卵黄清液过滤后再进行浓缩；(e)灭活：按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。其中，步骤(b)所述的除脂包括将卵黄与PBS缓冲液按照1：8的体积比混合均匀，置2～8℃静置16小时；步骤(c)中所述的萃取优选为：吸取并量取上清液体积，按体积比加入6％Tritionx-100，搅拌，升温至37℃，放置1～2h，取下层液体。步骤(d)中所述的过滤和浓缩优选为：将卵黄清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；步骤(e)中所述的灭活优选为按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。根据本专利技术的抗体免疫攻毒试验结果可见，用本专利技术制备的鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对新型鸭呼肠孤强毒的攻毒保护率分别为100％、100％和98％。用本专利技术制备的新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对1型和3型鸭肝炎强毒的攻毒保护率为98％～100％。本专利技术抗体可安全、有效的预防新型鸭呼肠孤病毒引起的以肝脏不规则坏死、脾脏坏死为特征性病变的鸭新型鸭呼肠孤病和鸭肝炎病毒引起的以肝脏肿胀和出血为主要病理变化的鸭病毒性肝炎，能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：/n(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；/n(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；/n(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；
(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；
(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得。


2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将鸭呼肠孤病毒疫苗株接种细胞，培养后收获细胞液，即得；
步骤(1)中所述的鸭肝炎病毒液抗原的制备方法包括，将鸭肝炎病毒疫苗株接种鸭胚，培养后收获尿囊液；优选的，将1型鸭甲型肝炎病毒JS株和3型鸭甲型肝炎病毒SD株分别接种易感鸭胚，培养后收获尿囊液。


3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的制备鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗的方法包括：
(a)油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却；(b)水相制备：将灭活后的3种病毒抗原混合均匀后再与吐温-80混合，吐温-80完全溶解混匀均匀；(c)乳化：将油相和水相混合乳化，即得。


4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；步骤(b)中将检验合格的3种病毒液按1:1:1的比例混合，再将混合液与吐温-80按95:5的比例混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；步骤(c)中将油相和水相以1:2比例乳化30min。


5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序为：(a)基础免疫：鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.5ml；(b)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(c...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋扬，柴华，徐刚，于镭，方超，刘艳昭，刘洋，田璐璐，张影，胡秀艳，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23