一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的制备方法是，提取鸡脾脏RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用套式PCR的方法，首先用能扩增鸡IFN-α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆IFN-α1编码基因，得到重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1。对本发明专利技术的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1采用在BHK-21细胞上进行鸡rIFN-α1抗新城疫病毒活性检测，显示鸡rIFN-α1最高活性单位达到4.32×103U.mg-1，利用SPF鸡胚培养病毒进行鸡rIFN-α1抗新城疫病毒活性检测，显示较高的抗病毒活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，特别涉及一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α 1的制备方法。
技术介绍
干扰素(interferon，IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤以及提高机体免疫功能的细胞因子，是机体防御系统的重要组成部分，并且以其作用广泛、残留小等特点，具有广阔的应用前景。天然干扰素产量低、纯化困难，限制了其应用。基因工程手段已经成为生产干扰素的常规方法，出现了许多具有抗病毒活性的基因重组鸡IFN-α表达蛋白。但在研制过程中也发现，由于鸡α-干扰素基因结构比较特殊，用克隆出的全长基因制备的重组表达质粒在大肠杆菌中进行表达，其产量较低，且表达产物的抗病毒活性也不理想，极大地限制了鸡干扰素的制备和应用。因此需要对其制备方法进行更新，更为简便高效地制备出抗病毒活性强的鸡干扰素，为临床应用提供大量安全、高效、新型的抗病毒干扰素，维护养殖业的健康发展。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于克服现有技术的不足，提供了一种能提高表达物产量、增强抗病毒活性的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α 1的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α 1的制备方法是，提取鸡脾脏RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用套式PCR的方法，首先用能扩增鸡IFN-α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆 IFN-α 1编码基因，得到重组鸡IFN-α核心片段rIFN_a 1。所述外引物参照GenBank中已登录的鸡a -干扰素的基因序列选用。所述内引物是利用Primer Premier 5. 0设计的去除了信号肽及部分非必须片段的内引物，包括上游内引物IFN- a CHA-S2和下游内引物IFN- a CHA-X2,上游内引物 IFN- a CHA-S2的序列为ACGAATTCATGCCACCTTCTCTCACGAC ；下游内引物IFN- a CHA-X2的序列为ACAAGCTTTCAGGTTGTGGATGTGCAGG ；上游内引物IFN-a CHA-S2带有EcoR I酶切位点GAATTC，下游内引物 IFN- a CHA-X2 带有 Hind III 酶切位点 AAGCTT。所述的重组鸡IFN-a核心片段rIFN-a 1的序列是去除了信号肽以及部分非必需片段的编码鸡IFN-a核心片段IFN-a 1的基因片段。纯化后的rIFN-a 1的蛋白浓度为0. 241mg/ml。所述的重组鸡IFN- α核心片段rIFN_ a 1在BHK-21细胞上抗新城疫病毒活性为 4. 32 X IO3U. mg-1。本专利技术的制备方法具体包括如下步骤1、引物设计合成与目的基因的克隆参照GenBank中已登陆的鸡α -干扰素的基因序列(登录号为鸡IFN-α :GGU07868)选择能扩增鸡α-干扰素的外引物，利用 Primer Premier 5. 0设计去除信号肽及部分非必须片段的上、下游内引物(参见表1)。其中的上游内引物IFN-α CHA-S2带有EcoR I酶切位点(表1中下划线部位)，下游内引物 IFN- α CHA-X2带有Hind III酶切位点(表1中下划线部位)。引物由上海生物工程有限公司合成。表1 Xl α -干扰素的外引物和内引物权利要求1.一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α 1的制备方法，其特征在于提取鸡脾脏RNA， 反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用套式PCR的方法，首先用能扩增鸡IFN- α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆IFN-α 1编码基因，得到重组鸡IFN- α核心片段rIFN- α 1。2.根据权利要求1所述的，其特征在于 所述外引物参照GenBank中已登录的鸡α -干扰素的基因序列选用。3.根据权利要求1所述的，其特征在于 所述内引物是利用Primer Premier 5. O设计的去除了信号肽及部分非必须片段的内引物， 包括上游内引物IFN- α CHA-S2和下游内引物IFN- α CHA-X2，上游内引物IFN- α CHA-S2的序列为ACGAATTCATGCCACCTTCTCTCACGAC下游内引物IFN-α CHA-X2的序列为ACAAGCTTTCAGGTTGTGGATGTGCAGG ；上游内引物IFN- a CHA-S2带有EcoR I酶切位点GAATTC，下游内引物IFN- a CHA-X2带有Hind III酶切位点AAGCTT。4.根据权利要求1所述的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-a1的制备方法，其特征在于 所述的重组鸡IFN-a核心片段rIFN-a 1的序列是去除了信号肽以及部分非必需片段的编码鸡IFN-α核心片段IFN-a 1的基因片段。5.根据权利要求1所述的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-a1的制备方法，其特征在于 纯化后的rIFN-a 1的蛋白浓度为0. 241mg/ml。6.根据权利要求1所述的重组鸡IFN-a核心片段rIFN-a1的制备方法，其特征在于所述的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-a 1在BHK-21细胞上抗新城疫病毒活性为 4. 32 X IO3U. mg-1。全文摘要一种是，提取鸡脾脏RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用套式PCR的方法，首先用能扩增鸡IFN-α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆IFN-α1编码基因，得到重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1。对本专利技术的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1采用在BHK-21细胞上进行鸡rIFN-α1抗新城疫病毒活性检测，显示鸡rIFN-α1最高活性单位达到4.32×103U.mg-1，利用SPF鸡胚培养病毒进行鸡rIFN-α1抗新城疫病毒活性检测，显示较高的抗病毒活性。文档编号C07K14/56GK102321630SQ20111024061公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日专利技术者朱建国, 李本强, 林 源, 王建民 申请人:上海交通大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组鸡ＩＦＮ－α核心片段ｒＩＦＮ－α１的制备方法，其特征在于：提取鸡脾脏ＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，采用套式ＰＣＲ的方法，首先用能扩增鸡ＩＦＮ－α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆ＩＦＮ－α１编码基因，得到重组鸡ＩＦＮ－α核心片段ｒＩＦＮ－α１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，王建民，林源，李本强，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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