本发明专利技术公开了一种重组鸭α－干扰素的制备方法，属于生物制药技术领域。该方法包括：（１）鸭α－干扰素基因合成；（２）引物的设计和合成；（３）表达载体的构建；（４）工程菌的诱导表达；（５）表达产物的提取、纯化、复性；（６）生物学活性测定等步骤组成。本发明专利技术重组鸭α－干扰素制剂纯度达９０％以上，每毫升细胞半数保护量达１０５ｕ以上，经临床应用其相对治愈率达９３％以上，且其价格低廉，为鸭病毒性肝炎治疗提供了一种安全有效，无毒副作用的新药剂，具有良好的社会效益和应用前景。本发明专利技术可在鸭养殖场和禽用制药企业推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及。
技术介绍
养鸭业在我国有着悠久的历史，无论是鸭的品种资源，还是生产数量均名列世界 前茅。随着养鸭业的迅速发展，鸭产品的大规模流通，鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒 病、鸭流感、番鸭呼肠孤病毒及新型鸭病毒性肝炎等新老疫病快速传播，其中，病毒病已成 为我国养鸭业的主要疫病，严重威胁养鸭业的健康发展。对于病毒性疫病，目前尚无高效的 治疗药物，采用疫苗免疫、高免血清被动免疫仍然是防治病毒性疾病的主要手段。但随着疫 苗的长期应用使一些病毒出现了变异，导致了超强毒力株和非典型毒株的出现，致使一些 传统疫苗的保护率出现下降趋势甚至无保护作用，而高免血清还潜在携带传播其他疾病的 危险。因些，养鸭生产上迫切希望能提供一些广谱、价廉的抗病毒新药。干扰素是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋 白，根据其理化和生物学特性分为α、β和Υ三类，其中α-干扰素以其突出的抗病毒作 用而备受人们重视，现已被广泛用于人医临床。α “干扰素除具广谱抗病毒活性外，还能抑 制肿瘤细胞增殖和参与调节免疫应答，具作用迅速、安全有效、无毒副作用、在体内存留时 间短、无药物残留等特点，且对病毒性疾病具有预防和治疗的双重效果，是一种绿色、环保 的抗病毒制剂，具有广阔的应用前景。然而有关禽类干扰素的研究却比较滞后，1994年鸡α -干扰素基因才得以克隆和 鉴定，随后Schultz等克隆了鸭α-干扰素基因，并展开了鸭基因工程干扰素抗病毒的研 究。近年来国内禽类α-干扰素的研究也取得了一定的进展，如鸡、北京鸭等α-干扰素基 因相继被克隆及表达，重组鸡α-干扰素已有用于抗病毒治疗的报道；但重组鸭α-干扰 素由于存在复性率低下等原因至今尚未见有用于临床的报道；而采用传统方法生产的干扰 素，存在产量低，成本高，成品价格极其昂贵等问题，根本无法在动物的疾病治疗中推广应 用。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对鸭病毒性疾病防治中由于常规疫苗长期使用已出现变异株， 致使保护率下降甚至无保护作用，而高免血清的使用潜在有携带传播其他疾病危险等问 题；提出一种价格低廉，安全有效，无毒副作用，在体内存留时间短，无药物残留，对鸭病毒 性疾病，尤其是对鸭病毒性肝炎具有预防和治疗双重效果高复性率的重组鸭α-干扰素的 制备方法。本专利技术目的通过以下技术方案来实现。—种重组鸭α -干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行(1)鸭α -干扰素基因合成将Genebank公布编号为Χ84764的鸭α -干扰素基 因序列进行合成；3(2)引物的设计和合成根据鸭α -干扰素基因序列设计用于扩增鸭干扰素成 熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5、端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物对的 序列为上游引物Pl 5“ -ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3“ 下游引物 P2 5~ -GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3~(3)表达载体的构建以合成的鸭α-干扰素基因为模板，用P1、P2引物扩增出鸭 a-干扰素成熟蛋白基因，经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET_28a (+) BamHI和EcoRI 的酶切位点，再转化入受体菌E. coli BL21-plsS，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验 证正确后作为工程菌保存；(4)工程菌的诱导表达将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液，37°C培 养过夜，次日将该菌液按2%的接种量接种与上述相同LB培养基中，37°C培养至0D_值为 0. 6 0. 7 ；加入最终浓度为Immol的IPTG诱导剂诱导培养4h ；取菌液4000转离心IOmin 收集菌体，置-70°C冰箱保存，备用；(5)表达产物的提取、纯化、复性将菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mMNaCl、IOmM β -巯基乙醇配制，ρΗ7. 8的裂解buffer按重量1 4比例重悬；用高压均质机在650帕 压力下，重复裂解两次，13000转离心20分钟，得沉淀物即提取的包涵体；将包涵体与由6M 盐酸胍、IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HClUOmM β -巯基乙醇配制，ρΗ 8. 0 的溶解 buffer 按 重量1 10比例用超声波重悬，室温下作用90min，10000转离心30min后，取上清液过镍 柱纯化，得带有组氨酸标签的纯度达90%以上的目的蛋白；将纯化后的目的蛋白装入透析 袋，先在由2M尿素、50mM醋酸缓冲液、IOmM β-巯基乙醇、50mM NaCl配制，ρΗ 3. 6的缓冲 液1中透析复性24小时，IOOOOg离心lOmin，取上清液；再在由50mM醋酸缓冲液、50mM NaCl 配制，PH 3.6的缓冲液2中透析复性48小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α-干 扰素；(6)生物学活性的测定采用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水 泡性口炎病毒VSV检测粗制重组鸭α “干扰素的生物学活性，其生物学活性为每毫升细胞 半数保护量达IO5U以上，即为重组鸭α -干扰素成品。重组鸭α _干扰素在防治鸭病毒性肝炎中的应用准对鸭病毒性肝炎发病急、死 亡快的特点，一旦发现患有该病的病鸭，应尽快将整群鸭肌注重组鸭α-干扰素，剂量为 IOOOu IOOOOu/只，每天一次连用3天，相对治愈率达到93%以上。本专利技术的有益效果是一、本专利技术将鸭α-干扰素成熟蛋白基因插入表达载体PET_28a(+) BamHI和EcoRI 酶切位点，这样表达出的鸭α-干扰素带有组氨酸标签，其组氨酸可与镍柱上的镍离子进 行螯合作用，经咪唑含量不同的缓冲液洗涤及洗脱，即可分离到纯度较高的带有组氨酸标 签的重组鸭α-干扰素。二、本专利技术采用高压均质机裂解表达的工程菌，达到快速、高效的破碎效果，较常 规裂解技术需加溶菌酶、去氧胆酸盐、DNA酶等共需作用1个半小时，既有利于大量生产、简 化了菌体裂解工艺，又明显降低了生产成本，为工业化生产奠定了基础。三、本专利技术采用的在醋酸缓冲液中进行透析复性的工艺，既在透析过程中使残留 的杂蛋白析出，使表达的鸭α-干扰素纯度达90%以上，又达到了极佳的复性效果，其生物4学活性为每毫升细胞半数保护量达到IO5U以上，比常规复性液的复性效果提高1000多倍， 实现了用于临床防治的要求。 四、本专利技术用制备的重组鸭α-干扰素进行了鸭病毒性肝炎的治疗试验，结果显 示具有非常有效的治疗效果，与不用干扰素治疗的对照组相比，其相对治愈率达到93%以 上，为鸭病毒性肝炎的治疗提供了一种安全有效，无毒副作用的新制剂(见实施例4)。具体实施例方式通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但应该理解这并非是对本专利技术的 任何限制。对所涉材料的说明载体 PET_28a (+)购自 Navagen ；BamHI 酶购自 Termanas ；EcoRI 酶购自 Termanas ；受体菌 E. coli BL21-plsS 购自 Tranagen ；IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)购自北京北实纵横科技发展有限公司；镍柱购自Invitrogen ；(洗涤液及洗脱液按说明书配方)鸭胚成纤维细胞系购自ATCC，编号CCL_141 ；水泡性口炎病毒VSV 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组鸭α－干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行： （１）鸭α－干扰素基因合成：将Ｇｅｎｅｂａｎｋ公布编号为Ｘ８４７６４的鸭α－干扰素基因序列进行合成； （２）引物的设计和合成：根据鸭α－干扰素基因序列设计用于扩增鸭ａ－干扰素成熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的５｀端分别加上ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点，该引物对的序列为： 上游引物Ｐ１：５｀－ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣ－３｀ 下游引物Ｐ２：５｀－ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＣＧＧＧＴＧ－３｀ （３）表达载体的构建：以合成的鸭α－干扰素基因为模板，用Ｐ１、Ｐ２引物扩增出鸭ａ－干扰素成熟蛋白基因，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切插入表达载体ＰＥＴ－２８ａ（＋）ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ的酶切位点，再转化入受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１－ｐｌｓＳ，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验证正确后作为工程菌保存； （４）工程菌的诱导表达：将阳性克隆菌接种含５０ｕｇ／ｍｌ卡那的ＬＢ培养液，３７℃培养过夜，次日将该菌液按２％的接种量接种与上述相同ＬＢ培养基中，３７℃培养至ＯＤ６００值为０．６～０．７；加入最终浓度为１ｍｍｏｌ的ＩＰＴＧ诱导剂诱导培养４ｈ；取菌液４０００转离心１０ｍｉｎ收集菌体，置－７０℃冰箱保存，备用； （５）表达产物的提取、纯化、复性：将菌体与由５０ｍＭ磷酸缓冲液、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ β－巯基乙醇配制，ｐＨ７．８的裂解ｂｕｆｆｅｒ按重量１∶４比例重悬；用高压均质机在６５０帕压力下，重复裂解两次，１３０００转、离心２０分钟，得沉淀物即提取的包涵体；将包涵体与由６Ｍ盐酸胍、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ↓［４］、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ β－巯基乙醇配制，ｐＨ ８．０的溶解ｂｕｆｆｅｒ按重量１∶１０比例用超声波重悬，室温下作用９０ｍｉｎ，１００００转离心３０ｍｉｎ后，取上清液过镍柱纯化，得带有组氨酸标签的纯度达９０％以上的目的蛋白；将纯化后的目的蛋白装入透析袋，先在由２Ｍ尿素、５０ｍＭ醋酸缓冲液、１０ｍＭ β－巯基乙醇、５０ｍＭ ＮａＣｌ配制，ｐＨ ３．６的缓冲液１中透析复性２４小时，１００００转离心１０ｍｉｎ，取上清液；再在由５０ｍＭ醋酸缓冲液、５０ｍＭ ＮａＣｌ配制，ｐＨ ３．６的缓冲液２中透析复性４８小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α－干扰素； （６）生物学活性的测定：采用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水泡性口炎病毒ＶＳＶ检测粗制重组鸭α－干扰素的生物学活性，其生物学活性为每毫升细胞半数保护量达１０５ｕ以上，即为重组鸭α－干扰素成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张存，叶伟成，刘蔓雯，张燕，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86
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