【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业昆虫分子生物学，具体涉及稻纵卷叶螟成虫在不同因子下稳定表达的内参基因及其引物和应用。
技术介绍
1、稻纵卷叶螟cnaphalocrocis medinalis(guenée)属节肢动物门昆虫纲鳞翅目螟蛾科昆虫，是为害水稻的重要迁飞性害虫，爆发时严重影响水稻产量，甚至可造成水稻绝收。稻纵卷叶螟成虫具有迁飞性，其种群爆发通常是突增突减的，且依赖于迁飞种群，因此难以对其进行动态预测。目前，对稻纵卷叶螟成虫迁飞的诱导因子已有部分研究，发现稻纵卷叶螟迁飞与成虫营养、交配状态及日龄等因素均有关。尽管对稻纵卷叶螟成虫迁飞的行为学和生态学已开展了广泛研究，但对调节该物种迁飞行为和生理变化的分子机制知之甚少，对稻纵卷叶螟的基因表达及其调控的研究有助于进一步了解其迁飞机制，挖掘与迁飞相关的功能基因，对于开发新的稻纵卷叶螟成虫防治技术具有重要意义。
2、研究稻纵卷叶螟迁飞机制和迁飞相关基因功能的最基本方法是对功能基因进行表达定量分析。荧光定量pcr是对功能基因进行定量研究的手段之一，但其依赖于相对稳定的内参基因来对功能基因表达数据进行校正和标准化，因此，选择合适的内参基因对研究结果的准确性至关重要。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术中缺少对稻纵卷叶螟成虫基因表达量分析的有效校正和标准化的内参基因的不足，提供稻纵卷叶螟成虫的内参基因及其引物。通过分析稻纵卷叶螟基因组数据，进行内参基因的开发；选取稻纵卷叶螟成虫不同日龄、不同营养状态、不同交配状态或不同起飞类型的候选内参
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术的第一方面提供了不同因子下的稻纵卷叶螟成虫内参基因组合。
4、在不同日龄下，在稻纵卷叶螟成虫中稳定表达的内参基因组合为pgk和rpl13。
5、在不同营养状态下，在稻纵卷叶螟成虫中稳定表达的内参基因组合为pgk、ef1α和act。
6、在不同交配状态下，在稻纵卷叶螟成虫中稳定表达的内参基因组合为pl18和pgk。
7、不同起飞类型的稻纵卷叶螟成虫中稳定表达的内参基因组合为rps3和pgk。
8、其中，所述pgk的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述rpl13的核苷酸序列如seqid no.6所示，所述ef1α的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述act的核苷酸序列如seq idno.12所示，所述rpl18的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述rps3的核苷酸序列如seq idno.8所示。
9、目前，虽然有一些管家基因如β-actin等常被用作内参基因，但大量的研究已证明没有任何一个内参基因mrna表达水平在所有的实验条件下都是恒定的。内参基因的选择会直接影响检测结果的准确性和可靠性。现在国内外未见基于荧光定量pcr筛选稻纵卷叶螟内参基因的相关报道。本专利技术的内参基因组合能在不同日龄或不同营养状态或不同交配状态或不同起飞类型的稻纵卷叶螟成虫中稳定表达，能用于荧光定量pcr检测稻纵卷叶螟成虫的相关研究中。
10、在一些实施方式中，所述不同日龄包括在稻纵卷叶螟羽化后的第1至第5天。
11、在一些实施方式中，，所述不同营养状态包括给与稻纵卷叶螟成虫充足营养(例如给与5％蜂蜜水喂养)和使稻纵卷叶螟成虫处于营养不足的情况下(如不提供食物使处于饥饿状态)。
12、在一些实施方式中，所述不同交配状态包括交配状态和未交配状态的稻纵卷叶螟成虫。
13、在一些实施方式中，所述不同起飞类型包括起飞和居留的稻纵卷叶螟成虫。
14、进一步地，本专利技术提供了所述内参基因组合中各内参基因的特异新引物。
15、在一些实施方式中，所述pgk的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq idno.22和seq id no.23所示。
16、在一些实施方式中，所述rpl13的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seqid no.24和seq id no.25所示。
17、在一些实施方式中，所述ef1α的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq idno.14和seq id no.15所示。
18、在一些实施方式中，所述act的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq idno.36和seq id no.37所示。
19、在一些实施方式中，所述rpl18的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seqid no.26和seq id no.27所示。
20、在一些实施方式中，所述rps3的正向引物和反向引物分的核苷酸序列别如seq idno.28和seq id no.29所示。
21、另一方面，本专利技术提供了所述内参基因组合在稻纵卷叶螟成虫荧光pcr定量检测方面的用途。
22、例如，在通过荧光定量pcr研究不同日龄下稻纵卷叶螟成虫中一种或多种基因的变化时，可以使用pgk和rpl13的组合作为内参基因组合，以使定量检测结果更加准确。同时，优选地，可使用上述pgk和rpl13的特异性引物。同理，研究不同营养状态下或交配状态下或不同起飞类型的稻纵卷叶螟成虫中一种或多种基因的变化时，选择上述对应的内参基因组合作为参照进行pcr扩增。
23、在一些方式中，pcr检测的步骤包括：取稻纵卷叶螟成虫，提取获得样品rna，使样品rna的吸光度a260/a280在1.90-2.10之间；将样品rna进行反转录得到cdna；以cdna为模板，添加所述内参基因组合中各内参基因的特异性引物进行pcr扩增；扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，运行40个循环。
24、再一方面，本专利技术提供了用于稻纵卷叶螟成虫荧光pcr定量检测的试剂盒，所述试剂盒含有上述内参基因组合中的内参基因的特异性引物。
25、所述内参基因的特异性引物有：pgk的正向引物seq id no.22和反向引物seq idno.23、rpl13的正向引物seq id no.24和反向引物seq id no.25、ef1α的正向引物seq idno.14和反向引物seq id no.15、act的正向引物seq id no.36和反向引物seq id no.37、rpl18的正向引物seq id no.26和反向引物seq id no.27、rps3的正向引物seq id no.28和反向引物和seq id no.29。
26、本专利技术通过选取稻纵卷叶螟成虫在不同日龄、不同营养状态、不同交配状态和不同起飞类型的样品；利用稻纵卷叶螟基因组数据，筛选出13种稻纵卷叶螟的待测内参基因；以候选内参基因的序列为模板，设计内参基因扩增引物；进行实时荧光定量pcr；通过五种不同算法(δct、genorm、normfinder、bestkeeper和reffinder)对待测内参基因稳定性进行分析，分别筛选出本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稻纵卷叶螟成虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，稻纵卷叶螟成虫在不同日龄下的内参基因组合为PGK和RPL13；
2.一种如权利要求1所述PGK的特异性引物，其特征在于，所述PGK的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
3.一种如权利要求1所述RPL13的特异性引物，其特征在于，所述RPL13的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示。
4.一种如权利要求1所述EF1α的特异性引物，其特征在于，所述EF1α的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
5.一种如权利要求1所述ACT的特异性引物，其特征在于，所述ACT的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示。
6.一种如权利要求1所述RPL18的特异性引物，其特征在于，所述RPL18的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.26和S
7.一种如权利要求1所述RPS3的特异性引物，其特征在于，所述RPS3的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示。
8.如权利要求1所述内参基因组合在稻纵卷叶螟成虫荧光PCR定量检测方面的用途。
9.一种用于稻纵卷叶螟成虫荧光PCR定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的内参基因组合中的内参基因的特异性引物。
...【技术特征摘要】
1.一种稻纵卷叶螟成虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，稻纵卷叶螟成虫在不同日龄下的内参基因组合为pgk和rpl13；
2.一种如权利要求1所述pgk的特异性引物，其特征在于，所述pgk的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.22和seq id no.23所示。
3.一种如权利要求1所述rpl13的特异性引物，其特征在于，所述rpl13的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.24和seq id no.25所示。
4.一种如权利要求1所述ef1α的特异性引物，其特征在于，所述ef1α的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.14和seq id no.15所示。
5.一种如权利要求1所述act的特异性引...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭嘉雯，赵晓昱，徐红星，吕仲贤，鲁艳辉，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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