一种重组猪α干扰素的制备方法技术

本发明专利技术构建并筛选获得了一株可以高效分泌表达猪α干扰素的重组毕赤酵母菌株PoIFN-α/GS115，克服了以大肠杆菌表达和制备重组干扰素存在纯化工艺复杂和生物学活性不高等问题，并建立了区别于传统高密度发酵工艺的，适于目的基因高效表达的特有发酵工艺。该发酵工艺生产周期短，纯化工艺简单且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
猪α干扰素(porcine interferon-a ,PoIFN-α )由猪白细胞产生的，约17个基因拷贝分布于I号染色体上，翻译出至少20多个IFN-α亚型，迄今只有部分被克隆、测序和表达。因为PoIFN-α具有良好的抗病毒活性，一直以来，人们尝试着利用基因工程的方法克隆、表达重组猪 a 干扰素(recombinant porcine interferon- α , rPoIFN- α ),使其具有天然PoIFN-α的广谱、高效的抗病毒活性。IFN-α是一种生物蛋白，它可高效诱导细胞产生抗病毒蛋白(AVP)等效应分子，AVP是一类酶类，作用无特异性，对多数病毒均有一定抑制作用。IFN-α既能在机体受感染的起始阶段，中断体内受传染细胞的病毒复制过程，限制病毒增殖、扩散，在体液免疫、细胞免疫发生作用之前发挥重要的抗病毒作用，又能及时且高效地激活、协调体液免疫和细胞免疫。rPoIFN-α是通过基因工程技术，将克隆获得的PoIFN-α基因与载体连接，导入受体细胞，表达产生的一种PoIFN- α，它具有天然PoIFN- α抗病毒的广谱性和高效性，已成为兽用生物制药领域的研究热点。基因工程菌的 密度发酵受诸多因素的影响和制约，主要表现在营养供给不适宜，生长抑制性物质的积累，溶氧，PH值，发酵液流变学特性及培养方式选择等。基因工程菌的高密度是在传统发酵基础上建立起来的，但却需要有新的调控概念，而且基因工程菌的高密度培养并不意味着外源基因的高效表达，因而需要进行深入的研究。以上这些因素都需要根据我们所表达的基因特性、菌种等进行不断的优化，探索出一套适于目的基因高效表达的发酵工艺。传统的毕赤酵母高密度发酵工艺均为“先生长后诱导”的模式，即首先利用甘油为碳源，历经约36-48h的生长期，使得工程菌达到一个较高的密度，一般湿重可达250g/L，随后用甲醇为诱导剂进行约72-120h的诱导表达，最后菌体密度一般可达450g/L左右，整个发酵过程历时108-168h。目前这种工艺为大部分人所应用，但是它在产业化应用的过程中却存在中明显的弊端，耗费大量的人力物力。我们在摸索适于目的基因高效发酵的发酵工艺过程中，进行了多种方法(包括高密度发酵工艺)的尝试，最终摸索出一套最适用本产品产业化的不同于高密度发酵工艺流程的“边生长边诱导”的发酵模式。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供，该方法生产周期短、纯化工艺简单且成本低。为解决上述技术问题，本专利技术包括以下步骤:(1)人工合成猪α干扰素基因，构建重组质粒，并将重组质粒转化到毕赤酵母细胞中，获得重组菌株；(2)发酵培养和诱导表达a.种子培养；b.将种子液接种于发酵罐中；c.重组菌株在种子液和发酵表达培养基的混合液中生长2h_4h ;d.以0.5ml/L/hr-2.5ml/L/hr的速度向发酵表达培养基中补加甲醇；e.蛋白达到最大表达量后,收集表达液；(3)检测重组猪α干扰素的活性。进一步地，所述人工合成的猪α干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。进一步地，种子培养的具体方法为:将菌株接种于YB)培养基，过夜培养，获得一级种子液；取一级种子液，以1:100-1:200比例接种于BMGY培养基，培养至0D600达到25-30左右，获得二级种子液。进一步地，步骤(2) b中，接种量为5%_10%。进一步地，步骤(2)d中，补加甲醇的优选方法为:第I小时，以0.5ml/L/hr的速度补加甲醇；第2小时，以0.75ml/L/hr的速度补加甲醇?’第3小时，以1-1.5ml/L/hr的速度补加甲醇；第4小时，以1-1.5ml/L/hr的速度补加甲醇；第5小时，以1.5-1.8ml/L/hr的速度补加甲醇；第6小时，以1.5-1.8ml/L/hr的速度补加甲醇?’第7小时，以2_2.5ml/L/hr的速度补加甲醇；然后保持2ml/L/hr的速度直至达到蛋白最大表达量。本专利技术采用“边生长边诱导”的发酵模式，相对于现有技术具有如下效果:1、生产周期短。本专利技术是在蛋白表达与菌体生产之间寻找一个平衡点，并不要求菌体一定要达到很高的密度后再进行蛋白诱导表达，同时省略补料生长期，因此整个生产周期较短，约为30-50h，而传统的高密度发酵工艺一般需要108-168h连续不间断的发酵，耗费较大的人力物力；2、纯化工艺简化。高密度发酵后发酵液中的菌体密度很高，需要经过多次反复离心才能得到较为纯净的上清，而本专利技术的工艺流程，最终的菌体密度只有高密度发酵工艺的1/3左右，一般经过一次离心即可获得较为澄清的上清；3、通过优化发酵培养基，缩短生产周期，简化纯化工艺，产品的成本相比高密度发酵工艺而言，可以下降20%-30%。【附图说明】图1为分泌型表达菌株PoIFN-a/GS115分别在0h、9h、20h、33h、44h、50h所得的蛋白上清的SDS PAGE图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。本专利技术使用的真核酵母表达载体pPIC9K为商品化试剂,购于Invitrogen公司。本专利技术使用的限制性内切酶EcoRl、SnaBl、Sail、Pfu DNA聚合酶、DNA MarkerDL2000/15000、T4DNA 连接酶，RNA 酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)等，均购自大连宝生物工程公司；小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海博彩生物工程有限公司。分子量标准蛋白购自上海升正生物技术有限公司，IPTG、尿素等购自上海生工生物技术有限公司；酶联葡萄球菌A蛋白(SPA)购自德国Calbiochem公司；蛋白胨和酵母提取物(OXID);YNB(Amresco公司)；生物素Biotin(BBI公司)；其余试剂为国产分析纯。本专利技术使用的培养基包括:(I)菌株保藏培养基(YPD):1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉；(2)生长培养基(BMGY):1 %酵母浸出物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4X10_5%生物素，1%甘油，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6.0) ;(3)发酵表达培养基(即改良的BMMY培养基):1 %酵母浸出物,2%蛋白胨，0.67%YNB，4 X 10、生物素，0.5-1.0 %甲醇，IOOmM磷酸盐缓冲液(PH6.0)。实施例1猪α干扰素基因的改造和人工合成根据已测定的猪α干扰素基因序列和表达载体PPIC9K的多克隆位点(MCS)序列，人工合成猪α干扰素基因序列。使合成的猪α干扰素基因序列以酵母喜好密码子为主。其序列如SEQ ID N0.1所示。实施例2重组质粒pPIC9K-PoIFN_ α的构建及鉴定表达1、重组质粒的构建以人工合成的猪α干扰素基因为模板，以IFN-a -Pl和IFN-α -Ρ2为引物，利用Pfu DNA聚合酶扩增得到的猪α干扰素基因，DNA产物为两端不带T的平端，以EcoR I酶切PCR产物使3'形成粘端。以SnaBl/EcoR I双酶切表达载体pPIC9K，同样形成5'端为平端，而3'形成粘端。将酶切后的猪α干扰素DNA片段和表达载体pPIC9K进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化。其中，引物IFN-`a-Pl序列如SEQ ID N0.2所示；引物IFN-α-Ρ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组猪α干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）人工合成猪α干扰素基因，构建重组质粒，并将重组质粒转化到毕赤酵母细胞中，获得重组菌株；（2）发酵培养和诱导表达a.种子培养；b.将种子液接种于发酵罐中；c.重组菌株在种子液和发酵表达培养基的混合液中生长2h?4h；d.以0.5ml/L/hr?2.5ml/L/hr的速度向发酵表达培养基中补加甲醇；e.蛋白达到最大表达量后，收集表达液；（3）检测重组猪α干扰素的活性。

【技术特征摘要】
1.一种重组猪α干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)人工合成猪α干扰素基因，构建重组质粒，并将重组质粒转化到毕赤酵母细胞中，获得重组菌株； (2)发酵培养和诱导表达 a.种子培养； b.将种子液接种于发酵罐中； c.重组菌株在种子液和发酵表达培养基的混合液中生长2h-4h； d.以0.5ml/L/hr-2.5ml/L/hr的速度向发酵表达培养基中补加甲醇； e.蛋白达到最大表达量后,收集表达液； (3)检测重组猪α干扰素的活性。2.根据权利要求1所述的一种重组猪α干扰素的制备方法，其特征在于，所述人工合成的猪α干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。3.根据权利要求1所述的一种重组猪α干扰素的制备方法，其特征在于，种子培养的具体方法为:将重组菌株接种于YPD培养基，过夜培养，获得一级种子液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一成，李宝臣，袁秀芳，蓝胜芝，张存，李军星，徐丽华，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：