用汉逊酵母表达系统产生HPV6 L1蛋白的方法技术方案

本发明专利技术涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV6?L1蛋白的方法。具体地，本发明专利技术公开了产生表达HPV6?L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明专利技术还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV6?L1蛋白的方法以及所产生的HPV6?L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
用汉逊酵母表达系统产生HPV6L1蛋白的方法专利
本专利技术属于医药生物工程
，涉及产生HPV6L1蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV6L1蛋白的方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类：1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV35、HPV59、HPV56、HPV39、HPV51等)：与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌，尤其以HPV16及HPV18型感染与宫颈癌的发生最为密切，这两个型别感染占宫颈癌感染的70％以上，其中HPV16占50％以上；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等)：可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等，其中由HPV6与HPV11诱发的尖锐湿疣占90％以上。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2，并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的L1蛋白或将L1蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)，又称作Pichiaaugusta，是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(PichiaPastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。专利技术概述在第一个方面，本专利技术提供了一种产生表达HPV6L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV6L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。在第二个方面，本专利技术还提供了根据上述方法产生的重组汉逊酵母细胞。在第三个方面，本专利技术还提供了一种产生HPV6L1蛋白的方法，包括以下步骤：i)在适于HPV6L1蛋白表达的条件下培养本专利技术的重组汉逊酵母细胞；和ii)从培养物中回收并纯化HPV6L1蛋白。所述方法还可以包括对所纯化的HPV6L1蛋白进行解聚和重聚的步骤。在最后一个方面，本专利技术还提供了根据本专利技术的方法产生的HPV6L1蛋白在制备用于预防HPV6感染的疫苗中的用途。附图说明图1以MOX启动子片段为探针的Southern印迹检测结果。以ATCC26012基因组DNA为对照。1：对照(上样量为：1000ng)；2：对照(上样量为：500ng)；3：对照(上样量为：250ng)；4：对照(上样量为：125ng)；5：HP/pRMHP2.1-6wt基因组DNA(上样量为：15.625ng，其亮度介于500ng和1000ng对照之间)；6：HP/pRMHP2.1-6sc基因组DNA(上样量为：15.625ng，其亮度介于500ng和1000ng对照之间)；7：HP/pRMHP2.1-6hp基因组DNA(上样量为：15.625ng，其亮度介于500ng和1000ng对照之间)。图2AHPV6L1蛋白在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE结果。1：蛋白标志物；2：未诱导的对照样品；3，4，5：IPTG诱导表达样品。图2B原核表达的HPV6L1蛋白的纯化结果。1：蛋白标志物；2：超声破碎后的上清液；3：超声破碎后的沉淀部分；4，5：流穿液；6：20％洗脱液；7：100％洗脱液。图2C兔多克隆抗体纯化结果。1：蛋白标志物；2：抗血清；3：流穿液；4：洗脱抗体。图3不同的重组汉逊酵母细胞表达水平的Western印迹检测。1：HP/pRMHP2.1-6wt；2：HP/pRMHP2.1-6sc；3，4：HP/pRMHP2.1-6hp；5：标准品(30μg/L)；6：预染蛋白标志物。图4发酵过程中HPV6L1蛋白的表达检测。1：预染蛋白标志物；2：标准品(30μg/L)；3：诱导0小时；4：诱导3小时；5：诱导6小时；6：诱导9小时；7：诱导10小时。图5AHPV6L1蛋白的POROS50HS纯化电泳图。1：上柱样品；2：流穿液；3～9：NaCl梯度洗脱。图5BHPV6L1蛋白的CHT纯化电泳图。1：上柱样品；2∶3～6∶磷酸盐梯度洗脱。图6纯化的HPV6L1蛋白的透射电镜观察结果。专利技术详述本专利技术人成功地建立了利用汉逊酵母产生HPV6L1蛋白的方法，所产生的HPV6L1蛋白能够自组装成病毒样颗粒，可用于制备预防HPV感染的疫苗。本专利技术首先提供了一种产生表达HPV6L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV6L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。本专利技术还包括根据所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。来源于不同HPV6病毒株的HPV6L1蛋白的氨基酸序列会存在差异。本专利技术人通过对数据库中所有的HPV6L1蛋白序列进行比对，在HPV6L1蛋白每个氨基酸位置上选取出现频率最高的氨基酸残基，获得了示于SEQIDNO：1的氨基酸序列，该序列是HPV6L1蛋白最具代表性的共有序列。因此，本专利技术中的HPV6L1蛋白优选具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。为了利用汉逊酵母高效地表达HPV6L1蛋白，专利技术人根据SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，针对汉逊酵母进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括：a)按照汉逊酵母遗传密码使用频率表(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生表达人乳头瘤病毒6型L1(HPV6L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：a)通过将包含编码HPV6L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。

【技术特征摘要】
1.一种产生HPV6L1蛋白的方法，包括以下步骤：a)产生表达人乳头瘤病毒6型L1(HPV6L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞；b)在适于所述HPV6L1蛋白表达的条件下培养a)中获得的重组汉逊酵母细胞；c)从培养物中回收并纯化所述HPV6L1蛋白；和d)对所纯化的HPV6L1蛋白进行解聚和重聚，其中a)中通过包含以下步骤的方法产生表达人乳头瘤病毒6型L1(HPV6L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞：a1)通过将包含与MOX启动子和MOX终止子可操纵地连接的SEQIDNO:4所示的HPV6L1蛋白编码序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQIDNO:15的载体来构建表达构建体；a2)用步骤a1)中获得的表达构建体通过电穿孔转化ATCC26012汉逊酵母细胞；和a3)用Zeocin和G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有拷贝数大于30的所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞；其中b)中的培养包括以下步骤b1)和b2)：b1)制备发酵种子液：取所述重组汉逊酵母细胞冻存甘油菌80μl接入5mlYPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养18-24hr至A600nm3-5，吸取1ml接入500mlYPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养18-24hr至A600nm15-20，作为发酵种子液待用；b2)发酵：2x500ml发酵种子液加入至30L发酵罐中的发酵起始培养基，发酵体积为15L；起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm3/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20-80％；起始生长期维持22hr后，菌液A600nm达到20，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基；培养6-8hr后，菌液A600nm达到90，停...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鼎锋，霍烛，陈星梅，程海，王贻杰，陈丹，刘娟，刘勇，
申请(专利权)人：北京安百胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：