本发明专利技术提供了一种可溶性CD83(soluble?CD83，sCD83)表达和制备的方法。利用本发明专利技术提供的方法，sCD83的表达量高达200mg/L，通过两步纯化，纯度可达95％以上。实验表明sCD83具有与天然CD83相似的生物学结构，具有与其天然受体结合的能力和很强的免疫抑制活性。此外，本发明专利技术还为sCD83的生产提供了一种简单而稳定的发酵工艺，并提供了针对所制备的sCD83的多克隆抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组蛋白的表达和制备领域，特别是涉及与抗原呈递和淋巴细胞活化有关的分子受体的表达。
技术介绍
⑶83是一种分子量为45kDa的表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。由炎症因子诱导，在包括淋巴细胞、朗格汉斯细胞、网状细胞等不同细胞表达。在人和小鼠树突状细胞成熟过程中，与协同刺激分子⑶80与⑶86 —样，⑶83选择性上调表达，因此曾经被用作成熟树突状细胞的特异性表面标记。在活化的B细胞和T细胞中，CD83似乎能调节B细胞的功能和成熟。大量的CD83同样表达在活化的调节性T细胞表面。进一步的报道表明，在体内或体外未接触抗原的T细胞中，CD83的强迫表达会诱导免疫抑制表型。存在膜结合的和可溶性的两种形式的⑶83蛋白。膜结合⑶83蛋白(mCD83)包含胞内区、跨膜区、胞外区三个结构域。胞外区包括一个V型免疫球蛋白结构域，而且其氨基酸组成在人和鼠之间显示出59%的一致性。总体上看，鼠科动物的⑶83分子与人的⑶83分子在氨基酸组成上有63%的一致性，因此，暗示其在人和小鼠中具有类似的功能。显示CD83 功能的第一个证据来自人树突状细胞感染不同病毒的实验，包括麻疹病毒、牛痘病毒和I型单纯疱疹病毒(HSV-1)。在HSV-1感染的成熟树突状细胞中，发生了通过细胞蛋白酶体的CD83的特异性降解，而这些树突状细胞对T细胞的刺激能力降低。此夕卜，通过阻碍CD83的mRNA从细胞核转运到细胞质来降低CD83的表达也导致了对T细胞刺激能力的降低。而且，在单核细胞来源的树突状细胞中，通过siRNA敲低⑶83的表达显示，CD83作为一个共刺激分子在树突状细胞中表达进而促进T细胞增殖。⑶83的表达情况高度影响⑶4+T细胞在胸腺中发育，这一点可以由⑶83敲除或者突变鼠中外周⑶4+T细胞的严重降低显示。而且，B细胞和⑶4+T细胞的寿命也依赖⑶83的表达。正如上面提到的，存在两种形式的⑶83分子，膜结合的(mCD83)和可溶性的(soluble⑶83，s⑶83)，两者具有不同的生物学功能。s⑶83仅包含mCD83的胞外区段而且具有免疫抑制功能。例如，感染了人巨细胞病毒后，树突状细胞会释放一种sCD83的同种型，表现出一种新的病毒逃逸机制。另外，在血液系统恶性肿瘤和风湿性关节炎患者中，发现了高水平的s⑶83。然而，s⑶83释放背后的机制仍然未被阐明。为了更加详尽的研究s⑶83的功能，⑶83的胞外段进行了重组表达。在这些研究中，s⑶83在大肠杆菌里表达，利用高压液相色谱纯化。突变分析显示，s⑶83通过二硫键形成二聚体。有趣的是，在体外使用该重组蛋白可以将树突状细胞介导的T细胞刺激途径阻塞而且树突状细胞的细胞骨架会被改变。sCD83的功能进一步的通过实验性自身免疫性脑脊髓炎模型来研究。在此模型中，无论是对于治疗还是预防，SCD83都具有很好的作用。尽管在上述描述中，原核表达的SCD83有很成功的应用，但是，其仍具有不少缺陷。首先，该重组蛋白是非糖基化的，而糖基化对于其在体外的稳定性和半衰期是很重要的。此外，在从原核细胞纯化该重组蛋白的过程中，不可避免的引入了一些富含LPS的碎片，进一步的纯化必须分离这些LPS碎片，这将给重组蛋白的产量带来不可忽略的降低。因此，一种可以生产大量的，无LPS污染的具有糖基化修饰的s⑶83的表达和纯化方法将是很有意义的。
技术实现思路
本专利技术涉及一种从酵母，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵大量表达和纯化具有功能活性的SCD83的方法。本专利技术中，我们首次利用酵母，如巴斯德毕赤酵母在基础盐培养基中高密度发酵表达S⑶83。表达量高于200mg/L，显著高于之前文献报道的其他方法的产量(约8_10倍)。通过两步纯化，纯度可以达到95%以上。进行了 N-糖基的鉴定，从几个角度验证了酵母表达的s⑶83具有应用价值和生物活性。此外，我们还为s⑶83的生产提供了一种简单但是稳健的发酵工艺。综上所述，甲醇利用型毕赤酵母一个是理想的s⑶83表达系统，为s⑶83进一步研究提供了充分的保障。具体内容如下:1.一种表达可溶性⑶83的方法，所述方法包括使用酵母构建重组可溶性⑶83表达菌株的步骤。2.一种制备可溶性⑶83的方法，所述方法包括以下步骤:使用酵母构建重组可溶性⑶83表达菌株；和对重组可溶性⑶83表达菌株进行发酵表达，优选地，在所述发酵中采用甲醇流加三步法进行重组可溶性CD83表达菌株的分批补料培养。 3.以上I或2的方法，其中所述酵母包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或多形汉逊酵。4.以上I或2的方法，其中所述酵母是甲醇利用型毕赤酵母，优选地，所述甲醇利用型毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母，更优选是巴斯德毕赤酵母GS115。5.以上I或2的方法，其中所述使用酵母构建重组可溶性⑶83表达菌株的步骤包括:构建可溶性⑶83表达载体；和转化和筛选重组可溶性⑶83表达菌株。6.以上5的方法，其中所述构建可溶性⑶83表达载体包括使用质粒PCMV6-XL4-⑶83为模板扩增可溶性⑶83基因；使用质粒pPIC9K构建重组可溶性⑶83表达载体；和将重组可溶性CD83表达载体转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞。 7.以上2的方法，所述方法还包括纯化重组可溶性⑶83的步骤，优选地，所述纯化包括以下步骤:固液分离；样品澄清；蛋白捕获；浓缩；和精细纯化。8.一种重组可溶性⑶83表达菌株，所述菌株通过以上1、3或4的方法获得。9.通过以上1-7中任一项的方法所制备或由以上8的重组可溶性⑶83表达菌株所表达的可溶性⑶83重组蛋白。10.以上9的可溶性⑶83重组蛋白用于对细胞膜表面潜在表达⑶83受体的细胞进行筛选分析的应用。11.以上9的可溶性⑶83重组蛋白用于免疫抑制活性的应用。12.一种多克隆抗体，其针对通过以上1-7中任一项的方法获得的可溶性⑶83。附图说明图1.在 P.pastoris 中构建 pPIC9K-sCD83_His 表达载体；图2.筛选来自YPDG板的s⑶83高表达克隆及pH、温度等表达条件优化；图3.P.pastoris 中 sCD83 发酵；图4.sCD83 纯化；图5.SCD83 表征；图6.sCD83pAb纯度及活性检测图7.s⑶83竞争细胞膜⑶83 ；图8.sCD83pAb/PE_CD83 的抗体竞争；图9.s⑶83与单核细胞上的假定⑶83受体结合，但不与T细胞结合，其中，线性曲线是s⑶83和PE-⑶83染色，且阴影曲线是对照；和图10.SCD83抑制ConA刺激的PBMC的增殖。具体实施例方式以下以巴斯德毕赤酵母为例进一步详述本专利技术。1.实验材料1.1菌株与质粒 巴斯德毕赤酵母菌株(P.pastoris)菌株GS115、pPIC9K载体购自Invitrogen公司。实验中所用细胞由健康人外周血中分离得到，血液样品由安徽省血液中心合肥市中心血站提供。1.2 试剂Yeast nitrogen base (YNB)购自 BD 公司；RPMI_1640 培养基购自 Hyclone 公司；胎牛血清购自Gibco公司；Yeast extract和Trypton购自OXOID公司；BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司；d_Sorbitol、d_biotin、质粒抽提试剂盒、PCR产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达可溶性CD83的方法，所述方法包括使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株的步骤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫华，郭雨刚，李锐，钟永军，贾皓，孙浩，田志刚，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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