本发明专利技术公开了一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺，其包括以下步骤：S1、根据大肠杆菌密码子的偏好性对Genebank中发表的鸡α干扰素基因序列进行密码子优化，人工合成该鸡α干扰素基因；S2、根据密码子优化后的鸡α干扰素基因，设计三条特异性的引物；S3、构建含ProS2促溶标签的重组鸡α干扰素质粒；S4、重组表达质粒的转化和鉴定；S5、重组鸡α干扰素的诱导表达；S6、表达产物的提取与蛋白复性纯化：S61、包涵体的提取与处理；S62、包涵体变性；S63、变性液复性；S64、镍柱亲和纯化。本发明专利技术通过细胞病变抑制法测出了该干扰素具有抑制水泡口炎病毒繁殖的活性，活性单位达到7.32×107UI/mg。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组
，特别涉及一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺。
技术介绍
干扰素是机体天然免疫系统重要的一员，其介导的抗病毒反应是天然免疫系统第一道防线。病毒入侵时，机体细胞可以通过细胞内外的模式识别受体对病毒进行识别，然后激活与干扰素相关的天然免疫信号通路，诱导干扰素基因的表达。表达的干扰素可以与其他细胞上的特异性受体结合，介导细胞内抗病毒信号的转导，产生抗病毒蛋白，从而有效抵抗病毒的入侵。自干扰素被发现以来，人类对干扰素的应用进行了多年、深入的专利技术。人类干扰素的应用研发历史可以分为三个阶段，第一阶段是天然原型干扰素，主要采用病毒诱导离体的人白细胞和人源转化细胞系合成干扰素，然后分离纯化干扰素。但其缺点是白细胞来源少；诱导出来的干扰素是各个亚型的混合物，疗效一般；另外，有病毒污染的风险。第二阶段是重组干扰素，80年代起已经具备干扰素的克隆以及基因改造的技术，因此主要采用基因工程和重组技术大量制备人类干扰素，同时提高了制品的纯度和效价，但该重组干扰素在体内的半衰期短，易被清除。第三阶段是长效干扰素的研制，在第二阶段的基础上，采用PEG化修饰、白蛋白融合技术制备，改善了药代动力学过程，提高了疗效。目前人类干扰素已经大规模临床应用于治疗多种病毒性疾病，如乙型肝炎等，取得了很好的疗效。与人类干扰素生物学功能类似，重组鸡干扰素是通过对自身免疫系统的调节来达到抗病毒的目的，与传统的化学药物、疫苗等兽用抗病毒生物制品相比，不会使病原产生耐药性突变和药物残留，因此近年来重组鸡干扰素的专利技术也越来越受到重视，尤其是鸡α干扰素在抗病毒感染等方面显出良好的效果。但由于目前鸡干扰素的生产过程较复杂，生产成本较高，市面上禽类重组干扰素的制品较少，还不具备大规模临床应用的条件。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺，其包括以下步骤：S1、根据大肠杆菌密码子的偏好性对Genebank中发表的鸡α干扰素基因序列进行密码子优化，人工合成该鸡α干扰素基因；S2、根据密码子优化后的鸡α干扰素基因，设计三条特异性的引物：P1CGCCATATGTGCAACCATCTGCGCCC；P2CGCGAATTCTCAGGTGCGGGTGTTGCCGG；P3CGCCCATGGATCACAAAGTGCATCA；S3、首先用引物P1和P2，以优化后鸡α干扰素基因作为模板，通过PCR扩增得到鸡干扰素片段，纯化回收PCR产物，用NdeI和EcoRI对纯化的干扰素片段及pCold-ProS2-ChIFN-α载体进行酶切，纯化酶切产物后连接，转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到载体pCold-ProS2-ChIFN-α；之后用引物P3和P2，以pCold-ProS2-ChIFN-α质粒为模板进行PCR扩增，得到带标签的鸡干扰素片段，对PCR产物进行纯化，之后用NcoI和EcoRI内切酶分别对pET28及PCR产物进行酶切，纯化回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到目的载体pET-28b-ProS2-ChIFN-α；S4、将测序正确的pET-28b-ProS2-ChIFN-α重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选、NdeI、EcoRI双酶切鉴定，进一步验证该重组阳性质粒；S5、将再次鉴定的BL21(DE3)E.coli/pET-28b-ProS2-ChIFN-α，接种于液体LB培养基，37℃震荡培养。OD值为0.6时，培养物中加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。继续培养5h之后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析，然后将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC)，Western-blot检测目的蛋白。由于目的蛋白含有His标签，所以用His标签抗体(1∶2000)作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶10000)作二抗。进一步地，还包括以下步骤：S6、表达产物的提取与蛋白复性纯化S61、包涵体的提取与处理:将1L诱导表达的重组菌E.coli/pET-28b-ProS2-ChIFN-α以10000r/min离心收集菌体，按1:5的菌体超声缓冲液重悬菌体，在冰浴的条件下，充分超声破碎，其中所述超声缓冲液为50mMTris，0.5mMEDTA，50mMNaCl，pH7.0；然后于4℃10000r/min离心15min收集沉淀，该沉淀即为粗制包涵体；离心收集的包涵体用洗涤缓冲液1充分悬浮，该洗涤缓冲液为150mMTris-HCl，0.5%TritonX-100，0.5MNaCl，pH8.0，磁力搅拌30min后，以10000r/min，4℃，20min进行离心；然后依次用洗涤缓冲液2和洗涤缓冲液3对包涵体进行洗涤；该洗涤缓冲液2为50mMTris-HCl，2MUera，1%巯基乙醇，2mMEDTA，0.15MNacl，pH8.0；该洗涤缓冲液3为50mMTris-HCl，4MUera，5mMDTT，0.5MNaCl，pH8.0；S62、包涵体的变性按1:5的包涵体变性液比例将洗涤后的包涵体溶解于8M尿素的变性液中该变性液为50mMTris-HCl，8MUera，5mMDTT，pH8.0；室温磁力搅拌6小时，然后以12000rpm，4℃，20min离心，收集变性液上清，4℃保存；S63、包涵体的复性采取梯度稀释法进行蛋白复性，复性时采用滴管悬滴，分三次把变性液加入到预冷的中，该复性液为50mMTris-HCl，0.15MNaCl，0.3ML-Arg，1mMGSSG，5mMGSH，10%甘油，pH7.0；每次加完后磁力搅拌5min，使变形液与复性液的比例达到1:10；完成后转入4℃冰箱，静置复性24h，通过Broadford法测定蛋白浓度，计算此重组鸡α干扰素的包涵体复性效率；S64、镍柱亲和纯化复性完成后，复性液经透析除去L-Arg，参照QIAGEN公司镍柱纯化说明书纯化His标签的目的蛋白，接着对纯化产物进行SDS-PAGE分析。一种鸡α干扰素优化基因，其序列如SEQIDNO：1所示。一种鸡α干扰素的氨基酸，其序列如SEQIDNO：2所示。对于鸡α干扰素这一类具有治疗效果的生物制品来说，其本质是有生物活性的蛋白质，因此，对于这一类生物制品的开发利用，其重要的是以较低的成本生产出生物活性较高的产品，因此本研究的重点就是研究如何以较低的成本实现鸡干扰素的高效表达以及提高鸡干扰素的复性效率（复性效率指的是无活性的包涵体恢复为具有活性的天然构象后可溶性蛋白占复性前包涵体蛋白的比例），从而获得较高生物活性的鸡干扰素。本专利技术用到的ProteinS存在于粘细菌的孢子衣中，由173个氨基酸残基组成，是一种非常稳定的可溶性蛋白质。将两个ProteinS的N-末端结构域串联，再结合ProS2Tag的作用能够促进蛋白质的正确折叠，就能使融合目的蛋白的稳定性和可溶性得到提高。本专利技术通过基因工程方法把鸡α干扰素基因与促溶标签ProS2连接，构建原核表达载体pET-28b-ProS2-ChIFN-α，结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据大肠杆菌密码子的偏好性对Genebank中发表的鸡α干扰素基因序列进行密码子优化，人工合成该鸡α干扰素基因；S2、根据密码子优化后的鸡α干扰素基因，设计三条特异性的引物：P1CGCCATATGTGCAACCATCTGCGCCC；P2CGCGAATTCTCAGGTGCGGGTGTTGCCGG；P3CGCCCATGGATCACAAAGTGCATCA；S3、首先用引物P1和P2，以优化后鸡α干扰素基因作为模板，通过PCR扩增得到鸡干扰素片段，纯化回收PCR产物，用NdeI和EcoRI对纯化的干扰素片段及pCold‑ProS2‑ChIFN‑α载体进行酶切，纯化酶切产物后连接，转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到载体pCold‑ProS2‑ChIFN‑α；之后用引物P3和P2，以pCold‑ProS2‑ChIFN‑α质粒为模板进行PCR扩增，得到带标签的鸡干扰素片段，对PCR产物进行纯化，之后用NcoI和EcoRI内切酶分别对pET28及PCR产物进行酶切，纯化回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到目的载体pET‑28b‑ProS2‑ChIFN‑α；S4、将测序正确的pET‑28b‑ProS2‑ChIFN‑α重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选、NdeI、EcoRI双酶切鉴定，进一步验证该重组阳性质粒；S5、将再次鉴定的BL21(DE3)E.coli/pET‑28b‑ProS2‑ChIFN‑α，接种于液体LB培养基，37℃震荡培养。OD值为0.6时，培养物中加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。继续培养5h之后，离心收集菌体，进行SDS‑PAGE分析，然后将SDS‑PAGE凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC)，Western‑blot检测目的蛋白。由于目的蛋白含有His标签，所以用His标签抗体(1∶2000)作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶10000)作二抗。...
【技术特征摘要】
1.一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据大肠杆菌密码子的偏好性对Genebank中发表的鸡α干扰素基因序列进行密码子优化，人工合成该鸡α干扰素基因；S2、根据密码子优化后的鸡α干扰素基因，设计三条特异性的引物：P1CGCCATATGTGCAACCATCTGCGCCC；P2CGCGAATTCTCAGGTGCGGGTGTTGCCGG；P3CGCCCATGGATCACAAAGTGCATCA；S3、首先用引物P1和P2，以优化后鸡α干扰素基因作为模板，通过PCR扩增得到鸡干扰素片段，纯化回收PCR产物，用NdeI和EcoRI对纯化的干扰素片段及pCold-ProS2-ChIFN-α载体进行酶切，纯化酶切产物后连接，转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到载体pCold-ProS2-ChIFN-α；之后用引物P3和P2，以pCold-ProS2-ChIFN-α质粒为模板进行PCR扩增，得到带标签的鸡干扰素片段，对PCR产物进行纯化，之后用NcoI和EcoRI内切酶分别对pET28及PCR产物进行酶切，纯化回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性克隆，测序确认，得到目的载体pET-28b-ProS2-ChIFN-α；S4、将测序正确的pET-28b-ProS2-ChIFN-α重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选、NdeI、EcoRI双酶切鉴定，进一步验证该重组阳性质粒；S5、将再次鉴定的BL21(DE3)E.coli/pET-28b-ProS2-ChIFN-α，接种于液体LB培养基，37℃震荡培养。OD值为0.6时，培养物中加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。继续培养5h之后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析，然后将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC)，Western-blot检测目的蛋白。由于目的蛋白含有His标签，所以用His标签抗体(1∶2000)作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶10000)作二抗。2.根据权利要求1所述的制备融合表达重组鸡α...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，焦培荣，吴斯宇，冯赛祥，孙超，孙俭波，廖想，
申请(专利权)人：华南农业大学，北京利昂盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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