【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业昆虫分子生物学，具体涉及稻纵卷叶螟幼虫在不同因子下稳定表达的内参基因及其引物和应用。
技术介绍
1、稻纵卷叶螟cnaphalocrocis medinalis(guenée)属节肢动物门昆虫纲鳞翅目螟蛾科昆虫，是为害水稻的重要迁飞性害虫，爆发时严重影响水稻产量，甚至可造成水稻绝收。稻纵卷叶螟幼虫具有很强的环境适应性，能适应外界温度的变化，针对高温或者低温采取一系列行为和生理等的适应性策略，还可针对不同品种水稻对其的防御反应采取反防御对策。此外，针对温度和不同品种水稻的适应性对策也因幼虫龄期而异，而且幼虫头部、肠道、脂肪体和表皮等组织应对外界环境变化会激活不同的适应性的生理和分子反应。了解稻纵卷叶螟幼虫适应环境的生理和行为的分子机制有助于增强对稻纵卷叶螟幼虫的环境适应性机制的认识并相应开发新型防控技术。
2、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点，被广泛应用于分子生物学上基因表达的定量检测及其相关研究。然而，在定量检测过程中，rt-qpcr定量结果会受多种因素的影响，如rna提取、cdna合成及pcr扩增效率等。为了减少或避免这些因素对结果的影响，需要对定量检测结果进行标准化处理，用内参基因进行校正。选择合适的内参基因对定量分析结果的准确性至关重要。同时，内参基因并不是在所有条件下通用的，使用未经筛选或不稳定的内参基因进行校正，可导致试验结果不准确，甚至远远偏离实际值。目前，尚无稻纵卷叶螟幼虫荧光定量pcr检测的内参基因及相关报道。
1、针对现有技术缺少稻纵卷叶螟幼虫基因表达量分析的有效校正和标准化的内参基因，本专利技术通过分析稻纵卷叶螟基因组数据，进行内参基因的开发；选取稻纵卷叶螟幼虫不同龄期、不同组织、不同品种水稻饲喂或不同温度处理的候选内参基因进行筛选和验证，获得适用于各因子下稻纵卷叶螟幼虫荧光定量pcr检测的内参基因及其引物。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术的第一方面提供了不同因子下的稻纵卷叶螟幼虫内参基因组合。
4、稻纵卷叶螟幼虫在不同龄期下的内参基因组合为rps3、gapdh和rpl18。
5、稻纵卷叶螟幼虫在不同组织的内参基因组合为rps3和rpl18；
6、稻纵卷叶螟幼虫在不同品种水稻饲喂下的内参基因组合为ef1β和pgk；
7、稻纵卷叶螟幼虫不同温度处理下的内参基因组合为ef1α、ef1β和pgk；
8、其中，所述rps3的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述gapdh的核苷酸序列如seqid no.4所示，所述rpl18的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述ef1β的核苷酸序列如seqid no.3所示，所述pgk的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述ef1α的核苷酸序列如seq idno.1所示。
9、内参基因的选择会直接影响检测结果的准确性和可靠性。目前，国内外未见稻纵卷叶螟幼虫荧光定量pcr用内参基因也无筛选稻纵卷叶螟幼虫荧光定量pcr用内参基因的相关报道。本专利技术的内参基因组合能在不同龄期或不同组织或不同品种水稻饲喂或不同温度处理下的稻纵卷叶螟幼虫中稳定表达，能用于荧光定量pcr检测稻纵卷叶螟幼虫基因的相关研究中，有助于稻纵卷叶螟幼虫的分子生物学研究。
10、在一些实施方式中，所述不同龄期稻纵卷叶螟幼虫包括1-5龄稻纵卷叶螟幼虫。
11、在一些实施方式中，所述不同组织包括给与稻纵卷叶螟幼虫的头部、肠道、脂肪体、表皮。
12、在一些实施方式中，所述不同品种水稻饲喂包括使用台中1号(tn1)、甬优1540、秀水134和中早39种水稻饲喂的稻纵卷叶螟幼虫。
13、在一些实施方式中，所述不同温度处理包括使用16、21、26、31、36℃处理稻纵卷叶螟幼虫1小时。
14、进一步地，本专利技术提供了所述内参基因组合中各内参基因的特异新引物。
15、所述rps3的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.28和seq idno.29所示。
16、所述rpl13的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.20和seq idno.21所示。
17、所述rpl18的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.26和seq idno.27所示。
18、所述act的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.18和seq idno.19所示。
19、所述pgk的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.22和seq idno.23所示。
20、所述ef1α的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.14和seq idno.15所示。
21、另一方面，本专利技术提供了所述内参基因组合在稻纵卷叶螟幼虫荧光pcr定量检测方面的用途。
22、例如，在通过荧光定量pcr研究不同龄期下稻纵卷叶螟幼虫中一种或多种基因的变化时，可以使用rps3、gapdh和rpl18的组合作为内参基因组合，以使定量检测结果更加准确。同时，优选地，可使用上述rps3、gapdh和rpl18的特异性引物。同理，研究稻纵卷叶螟幼虫不同组织、或不同品种水稻饲喂的稻纵卷叶螟幼虫、或不同温度处理下的稻纵卷叶螟幼虫中一种或多种目标基因的变化时，可选择上述对应的内参基因组合及其特异性引物进行荧光定量pcr，以获得目标基因的准确定量检测结果。
23、在一些实施方式中，荧光定量pcr进行定量检测的步骤包括：取稻纵卷叶螟幼虫，提取获得样品rna，使样品rna的吸光度a260/a280在2.0左右；将样品rna进行反转录得到cdna；以cdna为模板，添加所述内参基因组合中各内参基因的特异性引物进行pcr扩增；扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，运行40个循环。
24、再一方面，本专利技术提供了用于稻纵卷叶螟幼虫荧光pcr定量检测的试剂盒，所述试剂盒含有上述内参基因组合中的内参基因的特异性引物。
25、在一些实施方式中，所述试剂盒用于荧光定量pcr检测不同龄期下稻纵卷叶螟幼虫中目标基因时，所述特异性引物包括rps3的正向引物seq id no.28和反向引物seq idno.29、gapdh的正向引物seq id no.20和反向引物seq id no.21以及rpl18正向引物seqid no.26和反向引物seq id no.27。
26、在一些实施方式中，所述试剂盒用于荧光定量pcr检测稻纵卷叶螟幼虫不同组织的目标基因时，所述特异性引物包括rps3的正向引物seq id no.28和反向引物seq idno.29、rpl18的正向引物seq id no.26和反向引物seq id no.27。
27、在一些实施方式中，所述试剂盒用于荧光定量p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稻纵卷叶螟幼虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，稻纵卷叶螟幼虫在不同龄期下的内参基因组合为RPS3、GAPDH和RPL18；
2.一种如权利要求1所述RPS3的特异性引物，其特征在于，所述RPS3的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示。
3.一种如权利要求1所述GAPDH的特异性引物，其特征在于，所述GAPDH的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。
4.一种如权利要求1所述RPL18的特异性引物，其特征在于，所述RPL18的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示。
5.一种如权利要求1所述EF1β的特异性引物，其特征在于，所述ACT的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
6.一种如权利要求1所述PGK的特异性引物，其特征在于，所述PGK的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID
7.一种如权利要求1所述EF1α的特异性引物，其特征在于，所述EF1α的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
8.如权利要求1所述内参基因组合在稻纵卷叶螟幼虫荧光PCR定量检测方面的用途。
9.一种用于稻纵卷叶螟幼虫荧光PCR定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的内参基因组合中的内参基因的特异性引物。
...【技术特征摘要】
1.一种稻纵卷叶螟幼虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，稻纵卷叶螟幼虫在不同龄期下的内参基因组合为rps3、gapdh和rpl18；
2.一种如权利要求1所述rps3的特异性引物，其特征在于，所述rps3的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.28和seq id no.29所示。
3.一种如权利要求1所述gapdh的特异性引物，其特征在于，所述gapdh的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.20和seq id no.21所示。
4.一种如权利要求1所述rpl18的特异性引物，其特征在于，所述rpl18的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seq id no.26和seq id no.27所示。
5.一种如权利要求1所述e...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭嘉雯，赵晓昱，徐红星，吕仲贤，鲁艳辉，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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