本发明专利技术涉及细胞生物学和免疫学技术，特别涉及生物制品领域免疫佐剂的体外细胞筛选技术，具体涉及鸡胚成纤维细胞在体外筛选CpG寡聚脱氧核苷酸活性分子中的应用。将鸡胚成纤维细胞与CpG寡聚脱氧核苷酸混匀后放入细胞培养箱培养，对CpG寡聚脱氧核苷酸刺激所产生的增殖效果与淋巴细胞具有相同的规律。CEF用于CpG ODN的体外筛选不仅避免了核酸序列细胞毒性的干扰问题，扩大CpG ODN的浓度筛选范围，还正确区分体现了CpG ODN的结构与功能，与淋巴细胞相比，其免疫反应更强，更适合于CpG ODN免疫佐剂的体外筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学和免疫学技术，特别涉及生物制品领域免疫佐剂的体外细 胞筛选技术，具体涉及。
技术介绍
CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide，CpG 0DN)是含有未甲基化的CpG二核苷 酸基序的核苷酸序列，能够在机体内诱生强烈的免疫反应。CpG 0DN首先激活Toll样受体9/ 21(toll-like receptor 9/21，TLR-9/21)，而后经一系列信号转导诱导机体B细胞增殖分 化，刺激自然杀伤(NK)细胞的免疫保护活性;促进树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞等的抗 原递呈功能;激发T细胞活性，产生免疫调节级联反应。产生的效应物质中除免疫球蛋白外， 还包括Thl和Th2型细胞因子、前炎症细胞因子以及趋化因子，具有显著增强抗原体液免疫 和细胞免疫的作用。研究表明，人工合成的含未甲基化CpG基序的CpG 0DN和细菌DNA-样， 同样具有很强的免疫作用。 CpG 0DN的免疫刺激作用具有种属特异性，鸡的最佳刺激基序为5'-GTCGTT-3'。天 然的CpG 0DN进入体内和细胞后极不稳定，易受细胞内和血清中核酸水解酶的降解，B型CpG 0DN半衰期仅5min左右，C型也不过60min，因此在人工合成时多将CpG 0DN进行部分或者全 链的硫代修饰以防止序列的降解。然而，序列的硫代修饰往往会产生非特异性的细胞毒性 作用，影响细胞存活率，干扰试验结果。目前，体外筛选和研究CpG 0DN多用外周血分离的单 核细胞或者脾脏分离的淋巴细胞，其作用效应显著，但耐受细胞毒性的阈值较低，当CpG 0DN达到20yg/mL(鸡脾脏细胞浓度为5*106)时即出现细胞毒性的抑制作用，极大限制了 CpG 0DN最优工作浓度的全面筛选。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中淋巴细胞用于CpG 0DN体外筛选和研究时耐受细胞毒性 的阈值较低，无法全面准确获得最优工作浓度的问题，本专利技术提供了一种应用耐受力强的 鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)进行CpG 0DN体外筛选的方法。当CpG 0DN浓度大于80yg/mL(鸡脾脏细胞浓度为5*106)时，可作为宿主免疫应答研究起始点的鸡 胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)才表现出细胞损伤，增殖率受到影响。基 于此，我们以耐受力强的CEF为模型，通过测定细胞增殖和免疫应答效果进行CpG 0DN活性 分子的筛选，旨在建立利用CEF体外筛选CpG 0DN的体系，为体外筛选CpG 0DN提供更适合的 手段和方法。 本专利技术的目的是首先确定CpG 0DN刺激CEF产生的免疫反应能够正确体现序列结 构对其活性的影响。 本专利技术的另一目的是提供一种优于利用鸡淋巴细胞体外筛选CpG 0DN活性分子的 新方法。 本专利技术所述的确定CpG 0DN刺激CEF产生的免疫反应能够正确体现序列结构对其 活性的影响是通过测定不同序列CpG 0DN对CEF的增殖效果和相关免疫基因 mRNA表达量的 变化来实现的。 本专利技术是通过以下步骤得到的： 。 所述的应用，具体操作为待鸡胚成纤维细胞生长为单层细胞后与CpG寡聚脱氧核 苷酸共孵育，放入细胞培养箱培养。 所述的应用，鸡胚成纤维细胞对不同结构CpG寡聚脱氧核苷酸刺激所产生的增殖 效果与淋巴细胞具有相同的规律。所述的应用，优选CpG寡聚脱氧核苷酸序列为序列表中序列1-9中任一项序列。 所述的应用，优选CpG寡聚脱氧核苷酸工作浓度20yg/mL。 所述的应用，鸡胚成纤维细胞受到CpG寡聚脱氧核苷酸刺激后引发的免疫反应强 于淋巴细胞。 所述的应用，CpG寡聚脱氧核苷酸刺激鸡胚成纤维细胞后，免疫基因的表达增加量 高于或接近于使用淋巴细胞的表达增加量。 所述的应用，优选免疫基因为11^-2、几-6、11^-12、正^€鸡胚成纤维细胞对硫代CpG寡聚脱氧核苷酸的耐受浓度为80yg/mL。本专利技术的有益效果： CEF用于CpG 0DN的体外筛选不仅避免了核酸序列细胞毒性的干扰问题，对硫代 CpG寡聚脱氧核苷酸的耐受浓度为80yg/mL，扩大了CpG 0DN的浓度筛选范围，还正确区分体 现了CpG 0DN的结构与功能，与淋巴细胞相比，其免疫反应更强，更适合于CpG 0DN免疫佐剂 的体外筛选。【附图说明】 图1为CpG 0DN对IL-2表达量的影响， 图2为CpG 0DN对IL-12表达量的影响， 图3为CpG 0DN对IL-6表达量的影响， 图4为CpG 0DN对IFN-α表达量的影响， 图5为CpG 0DN对IFN-γ表达量的影响， 图6为CpG 0DN对TLR-21表达量的影响，图7为硫代CpG 0DN浓度对CEF增殖能力的影响。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明： 实施例1 1.1测定不同序列CpG 0DN对CEF的增殖效果。根据CpG 0DN的设计原则共设计序列 9条，其中A型2条，B型3条，C型3条，阳性、阴性对照各1条，序列如表1，分别对应序列表中的 序列1-9。表 1 CpG 0DN序列 然后将制备好的CEF密度调整为1*107个/mL，加入96孔细胞板，每孔100yL，置于37 °C、5 %⑶2细胞培养箱中培养24h，使CEF贴壁并生长成单层细胞。将CpG 0DN1-9用细胞培养 液稀释后分别加入细胞孔中，每孔终体积120yL，CpG工作浓度选择20yg/mL(便于与淋巴细 胞比较），轻轻混匀后放入细胞培养箱培养48h。每条CpG 0DN重复5孔，同时添加 roS替代CpG 0DN的阴性对照和无细胞的DMEM空白对照。在培养终止前4h，每个细胞孔加入MTT 10yL，继 续孵育4h，取出后弃上层营养液，按100μL7孔加入DMS0，置于摇床上晃动lOmin，使结晶紫完 全溶解。然后酶标仪上测定各孔0D490的值。 各CpG 0DN作用于CEF的效果以刺激指数(stimulation index,SI)来衡量，其计算 方法为SIGPGQDN=(0DGPGQDN-0D??(f^?)/(0D阴断r0D??(#,?)。计算不同序列CpG0DN刺激下CEF增 殖样品的0D490平均值，并得到相应的刺激指数。如表2所示，与无活性的CpG 0DN9、阴性对 照和空白对照相比，CpG 0DN1-8均可有效刺激细胞增殖，SI指数接近2,与CpG 0DN9差异显 著(P〈0.05)，其中CpG 0DN4、CpG 0DN6刺激效果最好，指数分别达到2.349、2.376。 表2不同序列CpG 0DN的刺激指数 CpG 0DN序列中凡含CpG基序的均能够刺激CEF的增殖，CpG 0DN9因序列中CG碱基 倒置而丧失刺激活性，甚至低于阴性对照值。CpG 0DN6和CpG 0DN4刺激指数最高，其序列内 部均含有回文序列，且序列5'端以TCG开头，不同之处在于CpG 0DN6的回文序列在5'端且包 含4个CpG基序，而CpG 0DN4回文序列靠近中部且只含3个CpG基序，所以CpG 0DN6的活性强 于CpG 0DN4<XpG 0DN5也含有回文序列，与CpG 0DN4不同在于回文序列中含GTCGTT，但刺激 活性并未增强，回文序列中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡胚成纤维细胞在体外筛选CpG寡聚脱氧核苷酸活性分子中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，刘伟杰，吴家强，徐敏丽，许传田，杨少华，黄艳艳，黄庆华，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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