用于快速再生血管化组织的人工结构体及构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体及其构建方法，所述人工结构体包含细胞/水凝胶微球、组织相关细胞、血管化细胞、生长因子缓释微球和载体材料。其中，细胞/水凝胶微球内部均匀分布组织相关细胞，微球外部含有血管化细胞层；载体材料中均匀分布细胞/水凝胶微球、组织相关细胞、血管化细胞、生长因子缓释微球。本发明专利技术的人工结构体可通过生物反应器培养获得具有类血管网络结构的血管化组织前体，或移植入体内再生血管化功能组织。获得的组织前体或功能组织具有一定生理功能，可用于组织发育、疾病发生、药物开发与检测、组织再生和修复等体内和体外研究。

Artificial structure for rapid regeneration of vascularized tissue and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
用于快速再生血管化组织的人工结构体及构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体及其构建方法与应用。
技术介绍
20世纪80年代组织工程开始应用于医学领域的研究，其目标是开发和最终应用生物代用品，以恢复、维持或改善组织功能。通过组织工程，可在实验室设计和制备生物工程化组织。可以将所述工程化组织植入体内以达到恢复、替代、维持或提高组织器官功能的目的。工程化组织的体内移植方式可分为创伤性移植和微创手术两种。临床使用时，工程化组织必须具有厘米级的较大体积，并且包裹大量细胞才能完成修复或替换体内受损组织的作用。大体积植入物对手术方式提出了较高要求，目前常用的仍是创伤性移植手术方式。注射式的微创手术方式由于其创伤小、疼痛感低、手术复杂度低、伤口隐蔽等特点受到医生和患者欢迎。大体积植入物在体内存活的另一个重大挑战则是快速、充分的血管再生，因为当每个细胞距离最近的血管的距离大于200μm时，就存在营养供给不足的问题，最终导致细胞坏死。而在没有外界条件干预的情况下，血管长入植入物的速度极慢，一般在几毫米/天的量级。血管化问题被认为是限制组织工程发展的瓶颈问题之一。目前成功的组织工程产品主要是皮肤植入物，其特点是二维尺寸较大，但在高度方向上尺度较小，对血管化要求不高。目前亟需可用于微创注射移植和快速体内血管化的工程化组织。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体及构建方法与应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体的构建方法，包括以下步骤：S1、组织细胞水凝胶微球的制备；S2、组织细胞水凝胶微球在细胞培养液内培养得到组织细胞微球，微球中细胞增殖和/或分化为离散细胞或呈细胞团簇状态；S3、将涂覆材料均匀涂覆在S2制备的组织细胞微球表面，得到具有涂层的组织细胞微球；S4、将血管化细胞A与S3制备的具有涂层的组织细胞微球混合，在血管细胞培养液内培养3-5天，得到含血管细胞层的组织细胞微球；S5、血管化生长因子1缓释微球的制备；S6、人工结构体的制备：将S4制备的含血管细胞层的组织细胞微球、S5制备的血管化生长因子1缓释微球、血管化生长因子2、血管化细胞B、组织细胞与载体材料混合，在含血管细胞培养液与组织细胞培养液的混合培养液内培养，即得可用于快速再生血管化组织的人工结构体。其中，所述血管化生长因子1、2为相同或不同的血管化生长因子；所述血管化细胞A、B为相同或不同的血管化细胞。本专利技术中，所述血管化生长因子为任意促进毛细血管发生和促进血管成熟的细胞因子。所述血管化生长因子1、2选自血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管生成素-1等血管相关生长因子中的至少一种，优选血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子；更优选地，所述血管化生长因子1为碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子，所述血管化生长因子2为表皮生长因子。在一些实施方案中，血管化生长因子的包裹方式包括但不限于被载体材料直接包裹、采用缓释载体包裹等，优选的包裹方式为采用缓释载体包裹。本专利技术中，所述血管化细胞A、B选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞等中的至少一种，这些细胞可以是组织中提取获得的，也可以是干细胞分化而来的，优选血管内皮细胞、间充质干细胞；更优选地，所述血管化细胞A、B为脐静脉血管内皮细胞、间充质干细胞或内皮祖细胞。本专利技术中，所述涂覆材料为生物可降解的，且具有生物活性、细胞粘附性和生物相容性天然生物材料，包括但不限于胶原、纤维蛋白原、matrigel。本专利技术中，所述载体材料为具有生物相容性的天然生物材料和/或人工合成生物材料。所述天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物等中的至少一种，优选藻酸钠、明胶或胶原。所述人工合成生物材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等中的至少一种，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。所述组织细胞选自肿瘤细胞、成纤维细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、免疫细胞、软骨细胞、骨来源细胞、肌腱细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、肝实质细胞、肝巨噬细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、肿瘤细胞、肝窦内皮细胞、胰腺细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤细胞、毛囊细胞、汗腺细胞以及其他各种组织和器官来源细胞中的至少一种，优选神经细胞、胰腺细胞、心肌细胞、皮肤细胞或肝实质细胞。前述方法中S1制备的微球平均直径为50-1000μm，S5制备的微球平均直径为10nm-100μm，且S5制备的微球平均直径小于S1制备的微球。例如S1制备的微球的平均直径可以为50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm或其间的任意数值。例如S4制备的微球的平均直径为10nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm或其间的任意数值。在形成水凝胶微球后，将涂覆材料与组织细胞水凝胶微球均匀混合，在一定的培养空间内静置培养或动态培养，直至所述涂覆材料与所述微球表面充分结合。所述培养空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间，如离心管、12孔板等。所述动态培养方法可选择本领域常用的仪器，如微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。在血管细胞培养液内，将步骤S3制备的具有涂层的组织细胞团进行静态培养或动态培养，使血管化细胞附着在所述材料涂敷层上，形成血管细胞层。所述培养空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间，如离心管、12孔板等。所述动态培养方法可选择本领域常用的仪器，如微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。采用的培养基和培养条件是本领域培养血管化细胞和/或组织细胞常用的，由本领域技术人员依据本领域的公知技术决定。前述方法中S5优选以藻酸钠为成囊材料制备微球。所述微球中藻酸钠的最终浓度为0.5％-10％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、组织细胞水凝胶微球的制备；/nS2、组织细胞水凝胶微球在细胞培养液内培养得到组织细胞微球，微球中细胞增殖和/或分化为离散细胞或呈细胞团簇状态；/nS3、将涂覆材料均匀涂覆在S2制备的组织细胞微球表面，得到具有涂层的组织细胞微球；/nS4、将血管化细胞A与S3制备的具有涂层的组织细胞微球混合，在血管细胞培养液内培养3-5天，得到含血管细胞层的组织细胞微球；/nS5、血管化生长因子1缓释微球的制备；/nS6、人工结构体的制备：将S4制备的含血管细胞层的组织细胞微球、S5制备的血管化生长因子1缓释微球、血管化生长因子2、血管化细胞B、组织细胞与载体材料混合，在含血管细胞培养液与组织细胞培养液的混合培养液内培养，即得可用于快速再生血管化组织的人工结构体；/n其中，所述血管化生长因子1、2为相同或不同的血管化生长因子；所述血管化细胞A、B为相同或不同的血管化细胞；/n所述涂覆材料为生物可降解的，且具有生物活性、细胞粘附性和生物相容性天然生物材料；/n所述载体材料为具有生物相容性的天然生物材料和/或人工合成生物材料。/n...

【技术特征摘要】
1.一种可用于快速再生血管化组织的人工结构体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、组织细胞水凝胶微球的制备；
S2、组织细胞水凝胶微球在细胞培养液内培养得到组织细胞微球，微球中细胞增殖和/或分化为离散细胞或呈细胞团簇状态；
S3、将涂覆材料均匀涂覆在S2制备的组织细胞微球表面，得到具有涂层的组织细胞微球；
S4、将血管化细胞A与S3制备的具有涂层的组织细胞微球混合，在血管细胞培养液内培养3-5天，得到含血管细胞层的组织细胞微球；
S5、血管化生长因子1缓释微球的制备；
S6、人工结构体的制备：将S4制备的含血管细胞层的组织细胞微球、S5制备的血管化生长因子1缓释微球、血管化生长因子2、血管化细胞B、组织细胞与载体材料混合，在含血管细胞培养液与组织细胞培养液的混合培养液内培养，即得可用于快速再生血管化组织的人工结构体；
其中，所述血管化生长因子1、2为相同或不同的血管化生长因子；所述血管化细胞A、B为相同或不同的血管化细胞；
所述涂覆材料为生物可降解的，且具有生物活性、细胞粘附性和生物相容性天然生物材料；
所述载体材料为具有生物相容性的天然生物材料和/或人工合成生物材料。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1制备的微球平均直径为50-1000μm，S5制备的微球平均直径为10nm-100μm，且S5制备的微球平均直径小于S1制备的微球。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述血管化生长因子1、2选自血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管生成素-1中的至少一种，优选血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子；
更优选地，所述血管化生长因子1为碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子，所述血管化生长因子2为表皮生长因子。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述血管化细胞A、B选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞中的至...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚睿，孙伟，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11