生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用生物胺促进诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟的方法与应用。本发明专利技术在固定的时间点向多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。并提供了检测组胺促进ips分化成心肌细胞的时间和浓度的方法。本方法成熟，操作简单，环境友好；此方法获得的细胞具有心肌细胞的特征性细胞表面标志和形态标志，能够自发性地周期性收缩，适用于心脏病的研究、药物筛选和细胞治疗等多种应用。

Method and application of differentiation of multi-functional stem cells into cardiomyocytes induced by biogenic amines

【技术实现步骤摘要】
生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及获得人心肌前体细胞和成熟心肌细胞系的方法与应用。
技术介绍
目前，诱导心肌分化的方法主要有两种，一种是诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)单层细胞培养法，即iPSCs在铺有基质胶的培养皿内培养，通过添加某些小分子化合物来调控心肌分化关键信号通路，以获得跳动的心肌细胞。另一种是形成类似胚胎结构的含有多种类型细胞的结构，即拟胚体法(EBs),EBs法诱导心肌分化过程是iPSCs纯化后经过数天的悬浮培养以诱导EBs形成，随后转移到明胶包被的培养皿中进行贴壁培养。EBs中细胞种类多，包括内、中、外三个胚层的细胞。目前从技术上可以使iPSCs分化为搏动心肌细胞，EBs方法模拟体内心肌分化的过程，更符合体内心肌分化的过程，但这种方法获得心肌细胞的分化效率和细胞纯度较低。iPSCs单层细胞培养法通过程序性调控Wnt,BMP等信号通路，在分化时间上更具有可操控性，可以具体到分化的各个主要阶段。随着研究的深入及技术的发展，细胞培养的方式得到改良和优化，如联合使用激活素A(activinA)、骨形态生成蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)或血管细胞生长因子(VEGF)等多种药物或生长因子可一定程度提高iPSCs源心肌的诱导分化效率，此外通过共培养的技术也能实现分化效率的一定提高。但总体来说，单层细胞方法分化培养时间长，培养基(生长因子)价格昂贵，一定程度地限制了多能干细胞向心肌细胞分化技术的应用。目前研究认为，iPSCs来源的心肌细胞类似于胎儿或胚胎期CMs,结构及功能上具有不成熟性，是制约其基础研究及临床应用的重要原因之一。大量的研究致力于探索促进分化心肌成熟的方法，例如通过延长体外培养的时间，机械和电刺激培养，添加化学因子等，但都有各自比较严重的缺陷。如体外延长培养时间不仅耗时耗力，而且细胞容易污染；给与机械和电刺激模拟在体心肌的微环境，具有一定的可行性，但效率不高；研究模拟体内心肌的生长环境给予不同的基质，发现能促进心肌的成熟及心肌线粒体的稳态，但这些基质价格贵且操作不够便捷。通过添加某些关键的化学因子促进心肌成熟，不仅简单易操作，而且可以通过高通量筛选具有明显促成熟的一些化学因子，特别是天然存在的，生物体内源性的一些小分子物质，更加符合心肌自然分化与成熟的过程。目前有研究报导维甲酸能显著促进iPSCs向心肌细胞分化，激素类如甲状腺素和G-CSF等可以促进分化心肌成熟。组胺(histamine)是由组氨酸脱羧酶(histidinedecarboxylaseHDC)催化组氨酸(histidine)脱羧生成的小分子生物胺。组胺通过作用于细胞表面的组胺受体，激活相应的细胞内信号通路进而发挥生物学效应，广泛参与生物体病理生理过程。除了在免疫调节及神经信号传递，胃酸分泌和免疫细胞分化等过程中发挥重要作用。本专利申请人前期研究中首先发现HDC在CD11b+不成熟髓系细胞高表达，而且内源性组胺缺失能够促进炎症相关肠癌的发生、发展，首先提出“内源性组胺是一种抑瘤因子”的科学假说。近期研究又发现内源性组胺缺乏HDC基因敲除小鼠心梗后心脏功能损害加重，早期外源性补充适当浓度的组胺能有效保护心肌损伤和心室重构。机制研究发现组胺受体H1R和H2R信号参与了组胺在调控免疫细胞功能和保护缺血性心血管疾病的作用。组胺参与造血细胞生成和神经细胞分化等过程，但组胺在心肌干细胞分化及心脏发育中的作用及机制，目前还没有相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种可丰富和改善现有的多能干细胞向心肌细胞分化成熟的方法，以达到缩短获得心肌细胞所需时间，提高获得的心肌细胞成熟度，增强移植的心肌细胞抗低氧、炎症损伤的能力，并可显著降低获得较大数量心肌细胞的成本的方法。本专利技术提供的能更高效地诱导多能干细胞分化成为心肌前体细胞和成熟心肌细胞的方法，具体为一种用生物胺促进诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟的方法，即通过在固定的时间点向常用的多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入适量浓度的组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。进一步的，本专利技术采用的组胺优选为二盐酸组胺。进一步的，本专利技术采用的组胺的浓度范围为10-7～10-5M，优先浓度为10-5M。进一步的，本专利技术的分化时间优选为3-5天。下面对本专利技术做进一步的详细说明。本专利技术采用分化效率高的化学成分既定法即通过调控Wnt信号通路来调控心肌分化的方法诱导心肌分化，首先我们在心肌分化的全程中给与不同浓度的组胺，通过检测多个心肌分化标志NKX2.5、a-actinin、cTnI、cTnT、MYH6和MYH7基因及蛋白表达，发现组胺在一定浓度范围内(10-7～10-5M)可以促进iPSC向心肌分化，并且在10-5M浓度下这种促分化效果更明显。进一步探究组胺发挥促进心肌分化的具体时间阶段，在iPSC诱导分化的不同时间加入10-5M浓度的组胺，通过检测心肌分化不同阶段标志基因BRACHYURY、MESP1、NKX2.5、GATA4、MEF2C及蛋白表达，发现在化学成分既定法的第3到5天给予10-5M组胺可以明显促进心肌前体细胞的得率，随后分化得来的心肌细胞结构及功能更加成熟。检测组胺促进ips分化成心肌细胞的关键时间窗和浓度，具体方法如下：a)在包被matigel胶的培养皿加入适量mTESR培养基，按1/1000比例加入Y试剂，即Y27632s1049selleck,ROCKinhibitor10uM，将消化好或复苏好的ips细胞加入其中，轻轻混匀，镜下观察，放入37℃细胞培养箱内；b)2小时后去掉培养液，加入不含Y试剂的mTESR培养基即可；c)每4天传代一次，具体根据细胞状态；细胞密度达到80-90％时开始分化；去除培养皿内的培养基，D-PBS洗一遍；加入8umol/LCHIR(GSK3β抑制剂s2924selleck)的RPMI1640+B27minusinsulin(GIBCO,A18956-01)的培养基，分化48小时；d)去除培养基，加入新鲜B27minusinsulin培养基24小时；去掉培养液，加入新的含5umol/LIWR-1抑制剂的RPMI1640+B27minusinsulin培养基；分化48小时，之后换RPMI1640+B27minusinsulin培养基两天，期间不用换液；7天后，分化好之后，换RPMI1640+B27withinsulin的培养基；以后每3天换一次液体；e)按上述方法分别在分化开始的不同天数的培养基中分别加入不同浓度组胺；f)分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测不同浓度的组胺对iPSC向心肌分化的促进效应。按上述方法分别在分化开始至第七天的培养基中分别加入10-4M、10-5M、10-6M组胺，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于，在固定的时间点向多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。/n

【技术特征摘要】
1.生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于，在固定的时间点向多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。


2.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的组胺为二盐酸组胺。


3.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的组胺的浓度范围为10-7～10-5M。


4.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的组胺的浓度为10-5M。


5.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的分化的时间为3-5天。


6.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于检测其中的组胺促进ips分化成心肌细胞的时间和浓度的方法为：
a)在包被matigel胶的培养皿加入适量mTESR培养基，按1/1000比例加入Y试剂，即Y27632s1049selleck,ROCKinhibitor10uM，将消化好或复苏好的ips细胞加入其中，轻轻混匀，镜下观察，放入37℃细胞培养箱内；
b)2小时后去掉培养液，加入不含Y试剂的mTESR培养基即可；
c)每4天传代一次，具体根据细胞状态；细胞密度达到80-90％时开始分化；去除培养皿内的培养基，D-PBS洗一遍；加入8umol/LCHIR的RPMI1640+B27minusinsulin的培养基，分化48小时；
d)去除培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨向东，丁素玲，朱小伟，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31