心肌细胞分离培养方法技术

本发明专利技术提供一种心肌细胞分离培养方法，包含以下步骤：1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1‑1mm

Methods of myocardial cell isolation and culture

【技术实现步骤摘要】
心肌细胞分离培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种体外心肌细胞的分离培养方法。
技术介绍
心肌细胞是一种终末分化的成熟细胞，在维持心脏正常形态、结构方面具有重要意义。近年来，心脏的生理、病理发展研究和心血管相关药物开发及药理探究多采用体外培养的心肌细胞作为研究对象。现有方法主要针对大鼠胎鼠或出生3天以内乳鼠的心肌细胞的分离，对成年大鼠和小鼠以及更多动物来源的心肌细胞的分离并不适用。然而在心肌细胞的细胞及分子学研究层面，往往需要获取成年动物或老龄化动物模型的心肌细胞或更多不同种属的心肌细胞，现行方法并不能满足研究需要。专利CN201611017279.X公开了一种心肌细胞分离方法，该方法采用单纯胰酶消化分离心肌细胞的方法。胰酶消化的原理是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是不同种属，甚至同一种属来源的不同组织对相同浓度胰酶的作用反应不一样。同时胰酶消化活力与其浓度、温度和时间均有关。采用单纯胰酶消化分离心肌细胞过程中，若对其中任一细节不能精准控制，会造成消化过度或消化不到位。消化过度即胰酶对细胞膜蛋白进行水解，对细胞造成不可逆损伤，最终影响分离后心肌细胞的活性；消化不到位则无法顺利将心肌细胞从组织中分离出来。专利CN201810915252.5公开了一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法,该方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶联合消化的方法进行分离。正常情况下，心肌组织间质中主要胶原类别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五种，其中Ⅰ型（占心肌胶原总量的80%）、Ⅲ型（占心肌胶原总量的11%）为主。采用Ⅱ型胶原酶进行分离，对Ⅰ、Ⅲ型胶原无法进行针对性水解消化。专利CN201610218220.0公开了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，该方法采用质量比为1:1:1:1的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶和Dispase酶（一种非特异性的金属蛋白酶）的复合酶进行4℃消化过夜的方式进行分离。此法可以对心肌组织中胶原成分进行针对性消化，有效减少胰酶对细胞的损伤风险。但是心肌细胞会随着离体时间的延长活性逐渐降低。复合酶中并无心肌细胞存活所必须的各种培养液组分，采用4℃低温消化时间过长，不利于心肌细胞分离后的活性维持。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种心肌细胞分离和培养方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种心肌细胞分离培养方法，包含以下步骤：1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1-1mm3的组织块，加入0.5-5mL的Ⅰ型胶原酶，36-37.5℃条件下震荡消化0.5-3小时；消化结束后加入2.5-50mLPBS进行稀释中止，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得细胞沉淀；2）将所述细胞沉淀用0.5-5mL胰酶进行重悬，弯头吸管吹打10-300次，消化液变浑浊后加入培养液终止胰酶消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得原代心肌细胞。3）将所述原代心肌细胞用培养液进行重悬后，按照0.1-10×105个细胞/cm2接种于培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，获得所述心肌细胞。优选地，所述PBS液体包含1-100×105UI的青霉素和1-100×105UI的链霉素。优选地，所述Ⅰ型胶原酶由DMEM配制而成，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为200-800U/mL。例如200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL或800U/mL。优选地，所述胰酶由PBS配制而成，所述胰酶的浓度为0.1％-0.35％。例如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％.优选地，所述培养液的组分包含10%胎牛血清和90%DMEM。优选地，步骤3）中，所述培养的时间为2-5天。相对于现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用Ⅰ型胶原酶和胰酶联合消化的方法进行心肌细胞消化分离，Ⅰ型胶原酶水解心肌组织中含量最多的Ⅰ型胶原，高效且彻底水解心肌组织间质成分，随后采用胰酶进行短时间的二次消化，进一步打散细胞团块，保证最终获取到单细胞悬液，在细胞逐步从细胞团块中分散时，消化液变浑浊，此时立即终止消化反应，可以避免胰酶消化过度，减少细胞损伤。同时采用36-37.5℃条件下消化，进一步保证Ⅰ型胶原酶处于酶活最强的作用温度。本专利技术使用PBS液体包含1-100×105UI的青霉素和1-100×105UI的链霉素，在清洗过程中，能有效抑制杂菌繁殖，保证种子细胞不被污染。本专利技术采用DMEM配制Ⅰ型胶原酶，DMEM中含有的Ca2+能够有效加强Ⅰ型胶原酶的活力，并且保证了在消化过程中心肌细胞代谢所需的养分；本专利技术的Ⅰ型胶原酶的浓度为200-800U/mL，能够满足对Ⅰ型心肌胶原进行水解。本专利技术所述胰酶由PBS配制而成，所述胰酶的浓度为0.1％-0.35％；该浓度不足以对细胞膜蛋白进行水解，不会造成消化过度或消化不到位，但因为占80%的Ⅰ型心肌胶原已被水解，剩余的20%胶原在胰酶的短时间作用下即可将心肌细胞分离出来。综上所述，本专利技术心肌细胞的分离培养方法，能够高效获取不同组织来源、活率高的心肌细胞，消化分离过程针对性强，细胞成活率高，得到的心肌细胞可以维持自发性搏动15天以上，保证其在体内原有的功能。附图说明图1为本专利技术实施例1分离培养的心肌细胞培养2天后的显微图；图2为本专利技术实施例2分离培养的心肌细胞培养2天后的显微图。具体实施例下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。实施例1本实施例提供一种6月龄成年大鼠心肌细胞的分离培养方法，包括如下步骤：将心肌细胞放置于PBS液体中进行清洗，直至洗净残留的血液；洗净后用眼科剪将心脏组织剪成0.5mm3的组织块；加入3mL的Ⅰ型胶原酶，37℃条件下震荡消化2小时；消化结束后加入10倍于Ⅰ型胶原酶体积的常温PBS液体进行稀释中止；1200rpm/min离心5min，弃上清。细胞沉淀用3mL胰酶进行重悬，弯头吸管吹打50次，消化液变浑浊后用培养液终止胰酶消化反应，1200rpm/min离心5min，弃上清；细胞沉淀用培养液进行重悬，细胞按照4×105个细胞/cm2接种细胞培养瓶、细胞培养皿或细胞培养的多孔板内，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。培养2天后显微镜下观察可见心肌细胞80%以上融合，见图1；倒置显微镜下可见明显的自发性搏动，配合秒表对搏动速率进行计数，搏动速率处于60-100次/min范围内，并能维持此速率连续搏动15天以上。实施例2本实施例提供一种出生3天内新西兰兔乳兔的心肌细胞的分离培养方法，包括如下步骤：将心肌细胞放置于PBS液体中进行清洗，直至洗净残留的血液，洗净后用眼科剪将心脏组织剪成0.5mm3的组织块；加入2mL的Ⅰ型胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.心肌细胞分离培养方法，其特征在于，包含以下步骤：/n1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1-1mm

【技术特征摘要】
1.心肌细胞分离培养方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）取心脏组织，使用PBS液体清洗掉残留的血液；用眼科剪将心脏组织剪成0.1-1mm3的组织块，加入0.5-5mL的Ⅰ型胶原酶，36-37.5℃条件下震荡消化0.5-3小时；消化结束后加入2.5-50mLPBS进行稀释中止，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得细胞沉淀；
2）将所述细胞沉淀用0.5-5mL胰酶进行重悬，弯头吸管吹打10-300次，消化液变浑浊后加入培养液终止胰酶消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，获得原代心肌细胞；
3）将所述原代心肌细胞用培养液进行重悬后，按照0.1-10×105个细胞/cm2接种于培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，获得所述心肌细胞。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：许珊珊，张勇杰，卢永波，
申请(专利权)人：广东博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44