松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用技术

本申请公开了一种松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，含量为0.8x10

Release protectant and its preparation and application of single cell suspension with high survival rate

【技术实现步骤摘要】
松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用
本专利技术涉及原代细胞获取的试剂领域，尤其涉及通过动物组织获取原代活细胞的试剂领域，具体涉及松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用。
技术介绍
原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。现有的原代细胞的获取方式都是通过制备细胞悬液来获取，然而细胞悬液的制备在现有的常用方式中可分为两种：一种是最为传统的物理制备方式，就是用研磨器进行手工研磨，手工研磨的弊端在于实用范围小，同时制备的单细胞悬液质量因操作者的经验而差别巨大，耗费时间非常长。另一种方式就是通过酶消化法，譬如胰蛋白酶是可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是实际处理过程中，单纯的将组织块置入胰蛋白酶中并不能直接获取到单细胞悬液，且对于胰蛋白酶的浓度、消化处理时间对于组织的裂解影响是非常大的，直接影响着单细胞的数量、完整度、以及存活率。现有的胰蛋白酶对于裂解组织至少需要静放2-4小时，然而，经过这么长的时间，细胞大多或死亡，或失去活性，而没有高存活率的单原代细胞是很难实现原代细胞的成功培养的，因此，含有胰蛋白酶或者同等功效的溶液对于获取高存活率、高单细胞率，确保细胞尽可能不遭受破坏非常重要。
技术实现思路
为了解决现有技术获取完整的，高存活率的单细胞悬液流程复杂，繁琐，不利于原代细胞培养进行的技术现状和技术问题，本申请提供一种松解保护剂，能够有效的裂解组织块，并在超声波的作用下，迅速的将组织块消融，获得单细胞悬液，且单细胞中存活细胞的比例高达90％以上，能够有效的在原代细胞获得流程上得以极大的简化，提高原代细胞的获得效率并保证原代细胞极高的存活率，解决了以存活原代细胞为实验基础和前提的诸多实验最头疼的一个技术环节。现有技术中，无论是采用传统的物理研磨的方式，还是通过酶解的方式在整个制备过程中花费的时间都是很长的，一般都会超过2小时，而细胞在这么长的时间内大多都已经失去活性了，甚至已经死亡，后续取得的单细胞悬液无论单细胞率的高低都已经没有了价值。譬如，单细胞测序、原代细胞培养的前提是必须保证制备的单细胞悬液中单细胞率和存活率都要非常高，二者缺一不可。为了解决现有技术中针对获取高存活率的单细胞，本申请提供了一种用于快速获取高存活率、高单细胞率，同时能够将使得制备好的单细胞悬液中的存活单细胞能够长时间的存活，这对于现有单细胞测序和原代细胞培养而言可谓是解决了最困难的一环。为了达到上述目的，本申请所采用的宋姐保护剂具体为：一种松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，含量为0.8x106～1.25x106U/L的胶原酶，以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。分散酶II，DispaseII，中文名分散酶II，一种非特异性金属蛋白酶，细胞生物学中常用于从不同的组织或器官分离单细胞，并用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。另外，DispaseII还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。与其他细胞生物学常用蛋白酶(如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等)相比，该酶具有以下优势：1)一种快速有效且温和的细胞消化酶，对细胞损伤小，且能维持细胞膜完整性；2)来源于细菌，无支原体或其他动物病毒污染；3)稳定性强，不受温度、pH及血清组分的影响；4)可用于多种类型组织和细胞的分离等。胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。为了更好的提高细胞的解离效果，同时处理经分散酶II和胶原酶水解后产生的明胶，本专利技术还包括0.065～0.174g/L的胰肽酶。明胶：是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具有同源性。胶原具有棒状三股螺旋结构，当其部分水解制备明胶的过程中，胶原的这种三螺旋结构发生部分分离和断裂。为了确保细胞生长内环境中的磷酸基团浓度，提供细胞存活的内环境，同时维持盐离子平衡，确保细胞存活的盐离子环境，本专利技术宋姐保护剂中还包括浓度为0.05～0.08g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3～0.6x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.22mol/L的氯化钠。为了提高分散酶II和胶原酶对组织中细胞的分散作用，还包括浓度为2.5x10-3～3.2x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5x10-3～6.5x10-3mol/L的氯化钾。目的是增加正价钙离子、镁离子和钾离子能够进一步的促进提高分散酶II和胶原酶的活性和作用。进一步地，在提高细胞存活的内环境平衡度，还包括浓度为3.8x10-3～5.0x10-3mol/L的碳酸氢钠。进一步地，为了避免内环境遭受破坏，经分散的单细胞被污染，松解保护剂中还包括100U/L～120U/L的青霉素,98～110mg/L的四环素,16～25mg/L的庆大霉素。上述抗菌剂中可以选择增加其中的一种或者多种，取决于实际的实验环境和组织的情况，确保整个组织在获取单个原代细胞中始终处于无菌环境，避免细胞或者细胞悬液遭受污染。为了更好的提高单细胞率和单细胞存活率，所述分散酶II的浓度分别为19-22g/L，所述卡那霉素的浓度分别为20-21g/L，胶原酶的含量为0.96x106～1.03x106U/L，葡萄糖浓度为0.98～1.03g/L，碳酸氢钠的浓度为4.0x10-3mol/L。进一步地，所述一水合磷酸氢二钠的浓度为0.06g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.45x10-3mol/L和氯化钠的浓度为0.14～0.16mol/L；氯化镁和氯化钙的浓度均为3.0x10-3～3.1x10-3mol/L，氯化钾的浓度为5.4x10-3～5.6x10-3mol/L。采用上述浓度能够尽可能的使得经分散后的单细胞得以完整的保留并存活。本申请的松解保护剂在获取高存活率单细胞悬液的应用中能够获取到相对于现有技术制备单细胞悬液显著的技术效果，主要体现在单细胞率指标和细胞存活率指标上，尤其是在细胞存活率上效果显著。本申请还提供了一种高存活率单细胞悬液的制备方法，采用松解保护剂对目标组织块进行浸泡，再采用超声消融仪对组织块进行消融，具体包括以下步骤：步骤S100，在无菌环境下取目标组织块，并用剪刀将组织块剪碎至不大于2mm3的小块；步骤S200，将目标组织块置于容器中用PBS缓冲液清洗，直到PBS缓冲液目测澄清为止，其中组织块的最大外部尺寸不超过2毫米；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.松解保护剂，其特征在于，由以下组分混合而成：/n浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，/n含量为0.8x10

【技术特征摘要】
1.松解保护剂，其特征在于，由以下组分混合而成：
浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，
含量为0.8x106～1.25x106U/L的胶原酶，
以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。


2.根据权利要求1所述的松解保护剂，其特征在于，还包括0.065～0.174g/L的胰肽酶。


3.根据权利要求1或2所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为0.05～0.08g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3～0.6x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.22mol/L的氯化钠。


4.根据权利要求1或3所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为2.5x10-3～3.2x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5x10-3～6.5x10-3mol/L的氯化钾。


5.根据权利要求4所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为3.8x10-3～5.0x10-3mol/L的碳酸氢钠。


6.根据权利要求5所述的松解保护剂，其特征在于，还包括100U/L～120U/L的青霉素,98～110mg/L的四环素,16～25mg/L的庆大霉素。


7.根据权利要求6所述的松解保护剂，其特征在于，所述分散酶II的浓度分别为19-22g/L，所述卡那霉素的浓度分别为20-21g/L，胶原酶的含量为0.96x106～1.03x106U/L，葡萄糖浓度为0.98～1.03g/L，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，邱坤，廖东升，
申请(专利权)人：成都导胜生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51