一种消融液、试剂盒、消融方法、提取线粒体的方法及其应用技术

本申请公开了一种消融液、试剂盒、消融方法、提取线粒体的方法及其应用，本发明专利技术提供的组织消融方法旨在获得能够保持细胞原有功能和活性的单细胞；同时进一步提供了针对单细胞进行线粒体的提取方法，旨在获得具有与活体细胞中的线粒体相当或者相同包括转录水平、功能和活性在内的主要功能的线粒体，从而使得针对线粒体异质性方面的后续研究具有多一种获取途径。本发明专利技术提供的消融方法获取的单细胞能够完整的保留细胞及其细胞器的功能，尤其是在线粒体的膜通透性和基因转录方面保留完好。粒体的膜通透性和基因转录方面保留完好。粒体的膜通透性和基因转录方面保留完好。

【技术实现步骤摘要】
一种消融液、试剂盒、消融方法、提取线粒体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及化学试剂及处理方法
，尤其涉及生物组织、细胞及细胞器的消融、提取
，具体涉及一种消融液、试剂盒、消融方法及提取线粒体的方法。

技术介绍

[0002]单细胞化是诸多生物实验中的基础，涉及到生物组织的实验，几乎都需要制备单细胞悬液用于后续研究和试验。现有的单细胞悬液的制备常用方式中可分为两种：一种是最为传统的物理制备方式，就是用研磨器进行手工研磨，手工研磨的弊端在较多，譬如耗时长，单细胞悬液质量差，受污染相对严重等。另一种方式就是通过酶消化法，譬如胰蛋白酶是可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是实际处理过程中，单纯的将组织块置入胰蛋白酶中并不能直接获取到单细胞悬液，且对于胰蛋白酶的浓度、消化处理时间对于组织的裂解影响是非常大，直接影响着单细胞的数量、完整度、以及存活率。而没有高存活率的单细胞往往将失去后续试验的意义。
[0003]进一步地，细胞的线粒体是维持基本的细胞功能，如能量生产，钙稳态，和调节细胞程序性死亡主要细胞器。大多数真核细胞拥有一群线粒体，这意味着线粒体mtDNA在每个细胞中有多个拷贝，每个分子的序列可以不同。线粒体异质性，从根本上是细胞内线粒体脱氧核糖核酸mtDNA的异质性往线粒体核糖核酸mtRNA传递并体现的。但目前mtDNA异质性往mtRNA异质性的传递一致性和机制尚不清楚。无法开展mtRNA异质性研究的主要原因线粒体转录水平对各种刺激敏感，比如缺氧，细胞损伤均会迅速改变线粒体RNA含量，造成难以获得转录水平未被意外激活的单细胞悬液或分离的线粒体。
[0004]因此，在保证线粒体转录水平，功能，活性不变的情况下，将组织样品制备成单细胞悬液并确保细胞线粒体结构、功能无损并维持转录水平不变是极具现实意义的。所获得的单细胞悬液可以用于线粒体分离，对样品细胞异质性与线粒体RNA异质性的相关性进行分析研究，从而通过这种方法学诊断细胞间异质性与线粒体异质性，并为线粒体疾病的治疗策略提供新的视角。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术在制备单细胞悬液过程中存在的存活率低，活性低，以及对细胞及细胞器造成损伤导致不能进行后续的细胞异质性及线粒体异质性研究的问题，本申请提供一种消融液、试剂盒、消融方法及提取线粒体的方法能够在在保证线粒体转录水平，功能，活性不变的情况下，将组织样品制备成单细胞悬液并确保细胞线粒体结构，功能无损并维持转录水平不变。使得可以通过本专利技术提供的方法获得结构和功能与活体细胞无异的单细胞；以及进一步从单细胞中提取线粒体，使得提取的线粒体具有的转录水平、功能和活性与处于活体中的线粒体基本相同，为线粒体RNA异质性研究提供必要基础。
[0006]本专利技术提供的组织消融方法旨在获得能够保持细胞原有功能和活性的单细胞；同时进一步提供了针对单细胞进行线粒体的提取方法，旨在获得具有与活体细胞中的线粒体
相当或者相同包括转录水平、功能和活性在内的主要功能的线粒体，从而使得针对线粒体异质性方面的后续研究具有多一种获取途径。
[0007]通过超声消融的手段将离体组织消融成单细胞的过程取决于两方面：第一是利用超声消融装置提供的高频物理作用，使得细胞与细胞之间实现分离；第二是通过消融液和松解液的共同作用使得细胞与细胞之间的粘附力降低，能够在尽可能温和的外力作用下实现分离。此处述及的温和是指作用于细胞的外力尚不足以对细胞造成实质性破坏和/或功能损害的力的作用；包括细胞本身的功能及细胞内部重要细胞器的功能，例如线粒体。针对超声消融装置而言，其输出的参数并非是固定的，需要配合消融液和松解液的混合液的实际作用效果以及针对需要消融的组织特性而定，但当配合消融的混合液浓度在相对一定的范围时，则超声消融装置的输出参数亦整体处于相对集中的范围内。当改变消融的混合液浓度及配方后，达到实质相同技术效果所需要调整的超声消融装置参数则具有明显且巨大的差异性。申请人经过长达数年的持续研究，虽不能穷尽一切可能实现的试剂与超声消融匹配的参数，但却获得了能够顺利获得保持原有组织细胞功能而获得单细胞的方法，以及适用于该方法的试剂配比，以及专用于该试剂配比的消融参数数据。
[0008]在进行消融时，须通过专有试剂盒配合超声消融装置实现。所述试剂盒由三种试剂液组成，分别为：
[0009]1、用于保护细胞组织的消融液，消融液具有极佳的组织保护作用，能够持续作用于离体组织，使得组织中的细胞功能活性得以持续和延续。本申请提供的消融液由0.3
‑
0.4mM/L的KH2PO4，0.14M/L的NaCl，5.2
‑
5.8mM/L的NaHCO3，4
‑
4.5mM/L的KCl，浓度为0.4％的BSA，0.1
‑
0.12g的Na2HPO4·
H2O，3mM/L的CaCl2，3mM/L的MgCl2和5
‑
10ug/mL溴化乙锭组成。
[0010]2、用于混合消融液形成消融混合液的松解液，松解液起到的是细胞间的松解作用，使得在超声接入时，能够在保证细胞及细胞器原有功能活性不受损害的前提下完成细胞间的分离，以获得理想的单细胞。所述松解液由下述组分及含量组成：DispaseII：20mg/mL；Collagenase：1000U/mL；kana：20mg/mL；KH2PO4:0.45mM/L；Nacl:0.14M/L；NaHCO3:4.2mM/L；KCl5.4mM/L；葡萄糖1.0g；Na2HPO4
·
H2O0.06g；CaCl2：3mM/L；MgCl2：3mM/L。
[0011]3、用于维持单细胞活力的细胞保护液，细胞保护液是保护并维持经消融后的单细胞活力的试剂，避免单细胞在短时间内降低活力、失去活力甚至死亡。其成分由PBS，10％FBS和浓度为0.1％的NaN3组成。
[0012]为了获得理想的单细胞，本申请提供了一种消融方法，基于上述试剂盒配合超声消融装置实现，以获得细胞内线粒体转录水平、功能和活性不受损伤的高存活化单细胞，具体通过以下步骤实现：
[0013]步骤ST100，在无菌条件下将获取待消融组织；
[0014]步骤ST200，将步骤ST100获取的组织转移至含有已经进行预冷处理的消融液的平皿中进行细化处理至2mm3的组织块，并利用消融液进行1
‑
3次清洗，直到组织无血液渗出为止；
[0015]步骤ST300，使用无菌眼科剪剔除目视可见非目标物；所述非目标物包括血管、结缔组织和纤维；
[0016]步骤ST400，将步骤ST300剔除非目标物后的组织置于盛装有消融液和松解液的EP管中，无菌环境下静止松解15分钟；其中，消融液和松解液体积比为4:1；
[0017]步骤ST500，将经步骤ST400松解后的组织利用超声消融装置进行消融6
‑
8秒，消融频率为20KHz，功率3
‑
8w；
[0018]步骤ST本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种消融液，其特征在于：由0.3
‑
0.4mM/L的KH2PO4，0.14M/L的NaCl，5.2
‑
5.8mM/L的NaHCO3，4
‑
4.5mM/L的KCl，浓度为0.4％的BSA，0.1
‑
0.12g的Na2HPO4·
H2O，3mM/L的CaCl2，3mM/L的MgCl2和5
‑
10ug/mL溴化乙锭组成。2.根据权利要求1所述的一种消融液，其特征在于：由0.3mM/L的KH2PO4，0.14M/L的NaCl，5.2mM/L的NaHCO3，4mM/L的KCl，浓度为0.4％的BSA，0.1g的Na2HPO4·
H2O，3mM/L的CaCl2，3mM/L的MgCl2和9.2ug/mL溴化乙锭组成。3.一种试剂盒，其特征在于：由松解液、细胞保护液和权利要求1或2中所述的消融液组成；所述细胞保护液由PBS，10％FBS和浓度为0.1％的NaN3组成。4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：所述松解液由下述组分及含量组成：DispaseI I：20mg/mL；Col lagenase：1000U/mL；kana：20mg/mL；KH2PO4:0.45mM/L；Nacl:0.14M/L；NaHCO3:4.2mM/L；KCl5.4mM/L；葡萄糖1.0g；Na2HPO4
·
H2O0.06g；CaCl2：3mM/L；MgCl 2：3mM/L。5.一种消融方法，其特征在于：通过权利要求4所述的试剂盒处理后的组织，配合超声消融装置进行消融获得细胞内线粒体转录水平、功能和活性不受损伤的高存活化单细胞，具体通过以下步骤实现：步骤ST100，在无菌条件下将获取待消融组织；步骤ST200，将步骤ST100获取的组织转移至含有已经进行预冷处理的消融液的平...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，余嘉莹，廖东升，
申请(专利权)人：成都导胜生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：