一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法，本发明专利技术采用RNA干扰技术，RNA干扰是植物在长期进化过程中形成的一种重要防御机制，利用RNAi技术去抑制其根系发育可有效的控制薇甘菊的扩散，为生物防治实践中通过RNA干扰技术抑制薇甘菊生长发育能力的靶向防控技术研究提供理论依据；通过筛选出拟南芥中已明确基因AtEXPA4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除AtEXPA4基因使主根生长缓慢。利用Blastp比对，以e

【技术实现步骤摘要】
一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法


[0001]本专利技术涉及生物防控相关领域，尤其涉及一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法。

技术介绍

[0002]薇甘菊，又称小花蔓泽兰或小花假泽兰，是菊科、假泽兰属多年生草质或木质藤本植物，薇甘菊作为一种入侵性杂草，生长速度快，其根系具有节节生根的能力，繁殖能力极强，薇甘菊的入侵对当地的农业和林业生产造成了巨大的经济损失；
[0003]中国专利：CN202210230108.4一种抑制薇甘菊快速生长的生物方法，薇甘菊柄锈菌对非靶标生物的安全性测定；薇甘菊柄锈菌侵染过程的确定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊生长表型的测定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊激素合成的测定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊光合作用的测定。本专利技术通过对薇甘菊叶片净光合速率、气孔导度的测量和卡尔文循环途径相关代谢物的含量分析，发现薇甘菊柄锈菌侵染后可显著降低叶片的光合速率和气孔导度并抑制卡尔文循环途径相关化合物的含量，其中，净光合速率下降了10.57％，气孔导度降低26.03％，卡尔文循环途径相关化合物的含量降低1.9至3.4倍。
[0004]根据现有技术和上述专利进行分析，得出存在问题为：都并非直接抑制薇甘菊根系发育，而是采用侵染过程来抑制其进行生长，虽说存在一定的抑制效果，但是从根本上来说抑制效果较弱。

技术实现思路

[0005]因此，为了解决上述不足，本专利技术提供一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法，方法步骤如下：
[0007]S1薇甘菊根系发育基因的筛选；
[0008]采用文献收集整理方法，筛选出模式物种拟南芥中已明确基因AtEXPA4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除AtEXPA4基因使主根生长缓慢，利用比较基因组学的方法，通过Blastp比对，以e
‑
value值<e
‑5为标准，筛选出关键候选基因，通过同源比对，鉴定关键候选基因的特异序列；
[0009]己功能验证基因：AtEXPA4；具有功能：敲除AtEXPA4基因使主根生长缓慢；Blastp比对后筛选出的基因：Mm14G033446；identity：84.49；e
‑
value：1.39e
‑
160
；
[0010]S2目的基因的克隆；
[0011]S3dsRNA的制备。
[0012]优选的，所述S2目的基因的克隆步骤如下：
[0013]S2.1总RNA提取，cDNA第一条链合成：
[0014]采用福际试剂盒方法提取薇甘菊叶片总RNA，通过紫外分光光度计检测样品RNA纯
度，cDNA的合成参照YESEN公司的试剂盒说明书进行。
[0015]S2.2基因的克隆；
[0016]根据筛选出基因Mm14G033446的序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计扩增正向引物(F)和反向引物(R)，对目的片段进行扩增，扩增体系为：模板cDNA 1μL，引物F 0.5μL，引物R 0.5μL，2
×
Hieff Robust Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，离心混匀后在PCR仪上进行扩增，94℃预变性5min，94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸10s，循环34次；72℃终延伸7min后放4℃保存备用；
[0017]制作1.5％的琼脂凝胶50mL，将PCR产物在凝胶中上样，用Bio
‑
Red电泳仪检测(110v，45min)，在紫外成像仪下观察结果，然后进行切胶回收，用DNA胶纯化回收试剂盒进行产物回收，得到目的片段；
[0018]用pUCm
‑
T Vector克隆试剂盒将目的片段与载体连接，反应体系为：插入片段3μL，pUCm
‑
T Vector 1μL，10
×
Ligation Buffer 1μL，50％PEG 40001μL，T4DNA Ligase 1μL，Sterilized ddH2O 3μL，将反应液置于16℃金属浴孵育6h后置于冰上冷却，将100μL DH5α感受态细胞从
‑
80℃冰箱取出置于冰上解冻后，加入上述10μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min，将混合液在42℃水浴中热激90s，再冰上冷却5min，为使载体上的抗性复苏，向反应液中加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃，200rpm/min摇床震荡培养1h，取出后4000rpm离心3min，吸除750μL上清液，将剩余反应液吹打混匀后涂布于含Amp的LB固体培养基上，倒置暗培养12h后挑取阳性单菌落，用M13通用引物进行菌液PCR验证，然后将菌液送公司测序验证，将测序正确的菌液利用试剂盒提质粒后置于
‑
20℃冰箱存放。
[0019]优选的，所述S3dsRNA的制备步骤如下：
[0020]S3.1PCR扩增；
[0021]在上述克隆步骤中扩增目的片段引物的5
’
端加上T7启动子序列作dsRNA合成的扩增引物，合成特异引物，以筛选出的质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为：质粒2μL，PrimerF 5μL，Primer R 5μL，2
×
HieffCanace Gold PCR Mix 50μL，ddH2O 38μL，离心混匀后在PCR仪上进行扩增，98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，循环34次；72℃终延伸5min；
[0022]S3.2PCR产物纯化；
[0023]S3.2.1PCR产物加水补足至500μl，加入等体积(500μl)酚氯仿异戊醇(25:24:1)，轻摇混匀并静置15min，后12000rpm离心15min；
[0024]S3.2.2取上清于另一RNase
‑
free离心管中，加入2
‑
3倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(PH＝5.2)；
[0025]S3.2.3将上述混合液置于
‑
20℃冰箱内1h或以上；
[0026]S3.2.4在4℃低温高速离心机中12000rpm离心10min；
[0027]S3.2.5弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，在4℃条件下12000rpm离心5min；
[0028]S3.2.6重复S3.2.5；
[0029]S3.2.7吸去上清，使酒精完全挥发，根据沉淀量加RNase
‑
free Water稀释；
[0030]S3.2.8取1μl PCR纯化产物加9μl ddH2O进行稀释，混匀离心，吸取1μl用紫外分光光度计Nanophoto meter P330测浓度并记录；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法，其特征在于：制备步骤如下：S1薇甘菊根系发育基因的筛选；采用文献收集整理方法，筛选出模式物种拟南芥中已明确基因AtEXPA4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除AtEXPA4基因使主根生长缓慢，利用比较基因组学的方法，通过Blastp比对，以e
‑
value值&lt;e
‑5为标准，筛选出关键候选基因；己功能验证基因：AtEXPA4；具有功能：敲除AtEXPA4基因使主根生长缓慢；Blastp比对后筛选出的基因：Mm14G033446；identity：84.49；e
‑
value：1.39e
‑
160
；S2目的基因的克隆；S3 dsRNA的制备。2.根据权利要求1所述一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法，其特征在于：所述S2目的基因的克隆步骤如下：S2.1总RNA提取，cDNA第一条链合成：采用福际试剂盒方法提取薇甘菊叶片总RNA，通过紫外分光光度计检测样品RNA纯度，cDNA的合成参照YESEN公司的试剂盒说明书进行。S2.2基因的克隆；根据筛选出基因Mm14G033446的序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计扩增正向引物(F)和反向引物(R)，对目的片段进行扩增，扩增体系为：模板cDNA 1μL，引物F 0.5μL，引物R 0.5μL，2
×
Hieff Robust Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，离心混匀后在PCR仪上进行扩增，94℃预变性5min，94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸10s，循环34次；72℃终延伸7min后放4℃保存备用；制作1.5％的琼脂凝胶50mL，将PCR产物在凝胶中上样，用Bio
‑
Red电泳仪检测(110v，45min)，在紫外成像仪下观察结果，然后进行切胶回收，用DNA胶纯化回收试剂盒进行产物回收，得到目的片段；用pUCm
‑
T Vector克隆试剂盒将目的片段与载体连接，反应体系为：插入片段3μL，pUCm
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T Vector 1μL，10
×
Ligation Buffer 1μL，50％PEG 40001μL，T4 DNA Ligase 1μL，Sterilized ddH2O 3μL，将反应液置于16℃金属浴孵育6h后置于冰上冷却，将100μL DH5α感受态细胞从
‑
80℃冰箱取出置于冰上解冻后，加入上述10μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min，将混合液在42℃水浴中热激90s，再冰上冷却5min，为使载体上的抗性复苏，向反应液中加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃，200rpm/min摇床震荡培养1h，取出后4000rpm离心3min，吸除750μL上清液，将剩余反应液吹打混匀后涂布于含Amp的LB固体培养基上，倒置暗培养12h后挑取阳性单菌落，用M13通用引物进行菌液PCR验证，然后将菌液送公司测序验证，将测序正确的菌液利用试剂盒提质粒后置于
‑
20℃冰箱存放。3.根据权利要求2所述一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法，其特征在于：所述S3 dsRNA的制备步骤如下：S3.1PCR扩增；在上述克隆步骤中扩增目的片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘博，钱万强，欧正慧，乔曦，申时才，万方浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：