利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法技术

本公开提供了一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，包括：在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；对第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；将第一滤膜剪碎与第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对混合物行进纯化获得胞内DNA；将第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。

【技术实现步骤摘要】
利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法


[0001]本公开涉及DNA提取
，尤其是涉及一种适用于畜禽养殖和污水处理领域中的胞内外DNA的分离方法。

技术介绍

[0002]抗生素耐药性的出现和传播给全球公众健康带来了极大的威胁，随着抗生素在医疗和畜禽养殖中的大量使用，越来越多的微生物出现了抗生素的耐药性，严重威胁了人类健康。抗生素抗性基因(ARGs)作为抗生素抗性的遗传工具，可以在微生物之间甚至是病原菌之间传播。抗性基因包括两种存在形式：存在于微生物细胞内的胞内抗性基因(iARGs)和裸露在环境中的胞外抗性基因(eARGs)。ARGs在环境中以细胞内DNA(iDNA)和细胞外DNA(eDNA)的形式存在。
[0003]目前关于胞内外ARGs的研究成为热点，因此从环境样品中分离纯化细胞内外DNA成为研究细胞内外ARGs的重要实验步骤。在很多研究中都有使用与提及。但是这些方法存在一些问题，例如：过程繁琐，所用沉淀核酸的有机溶剂具有挥发性毒性，对于较少的胞外DNA的获取具有杂质较多且不纯等缺陷，以及不能同时测定胞内、外DNA的缺陷。不能高效安全提取细胞中的iDNA和eDNA，从而限制了从基因水平研究ARGs的转归。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本公开提供了一种提取胞内外DNA的方法，该方法能够实现胞内外DNA的快速高效获取，并且通过预处理后的样品可分别进行胞内外DNA的提取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
[0005]根据本公开一个方面的实施例，提供一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，包括：
[0006]在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；
[0007]在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；
[0008]对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；
[0009]将所述第一滤膜剪碎与所述第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA；
[0010]将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及
[0011]通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。
[0012]根据本公开的一些实施例，所述提取方法还包括：
[0013]对液态样品进行过滤得到第二滤膜和第二滤液；
[0014]将所述第二滤膜剪碎与所述第一沉淀物和剪碎的第一滤膜混合得到所述混合物；
以及
[0015]将所述第二滤液与所述第一滤液混合后静置持续第二预设时间，离心并弃上清后得到所述第二沉淀物。
[0016]根据本公开的一些实施例，所述在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间包括：
[0017]将固态样品与0.1mol/L的PBS缓冲液按照1：4混合，加入的蛋白酶K后在35～40℃的条件下水浴30～40min。
[0018]根据本公开的一些实施例，所述水浴过程中，每间隔10min进行摇匀重悬。
[0019]根据本公开的一些实施例，所述在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液包括：
[0020]在混合溶液中添加PVPP崩解剂后，在200～300rpm、20～30℃的条件下震荡10～15min，将混合溶液在0～5℃环境下离心25～30min得到第一沉淀物和第一上清液。
[0021]根据本公开的一些实施例，所述对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液包括：
[0022]对所述第一上清液采用0.22μm的滤膜进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。
[0023]根据本公开的一些实施例，所述将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物包括：
[0024]在所述第一滤液中加入等体积的异丙醇和1/10体积的乙酸钠，在
‑
25℃～
‑
15℃的环境下静置8～12h，在0～5℃环境中离心25～30min后弃上清后得到第二沉淀物。
[0025]根据本公开的一些实施例，所述通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA包括：
[0026]将所述混合物放入第一离心管中，在所述第一离心管中加入缓冲液SA、缓冲液SC和研磨珠后涡旋振荡混匀，离心，将离心后的上清液转移至第二离心管中；
[0027]在所述第二离心管内加入裂解液SH混合均匀，在0～5℃的环境下静置一段时间，离心并将上清液转移至第三离心管；
[0028]在第三离心管内添加缓冲液GFA后摇匀，加入磁珠悬浮液，震荡混匀；
[0029]将第三离心管放置在磁力架上静置一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，添加蛋白液RD后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
[0030]在第三离心管内加入漂洗液混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
[0031]在第三离心管内加入洗脱缓冲液后混匀，水浴一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞内DNA的溶液，保存。
[0032]根据本公开的一些实施例，所述通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA包括：
[0033]将所述第二沉淀物放入第四离心管内，加入裂解液CFL、蛋白酶K和磁珠后混匀；
[0034]将所述第四离心管放置在磁力架上，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
[0035]在所述第四离心管内添加去蛋白液PD混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
[0036]在所述第四离心管内加入漂洗液RW后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，重复执行该操作预设次数后获得待洗脱磁珠，晾干；
[0037]在所述待洗脱磁珠内加入洗脱缓冲液TBC，利用移液器吹打重悬磁珠，利用磁力架
吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞外DNA的溶液，保存。
[0038]根据本公开的一些实施例，所述固态样品包括动物粪便和/或活性污泥，所述液态样品包括污水处理厂退水口水样。
[0039]根据本公开实施例的提取方法，通过对样品进行预处理后分离出固态的沉淀物用于提取胞内DNA，以及液态的滤液用于提取胞外DNA，能够实现胞内、外DNA的快速高效获取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
附图说明
[0040]图1示意性示出了本公开实施例的利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法的流程图。
具体实施方式
[0041]为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。
[0042]但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，其特征在于，包括：在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；将所述第一滤膜剪碎与所述第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA；将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，还包括：对液态样品进行过滤得到第二滤膜和第二滤液；将所述第二滤膜剪碎与所述第一沉淀物和剪碎的第一滤膜混合得到所述混合物；以及将所述第二滤液与所述第一滤液混合后静置持续第二预设时间，离心并弃上清后得到所述第二沉淀物。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间包括：将固态样品与0.1mol/L的PBS缓冲液按照1：4混合，加入的蛋白酶K后在35～40℃的条件下水浴30～40min。4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述水浴过程中，每间隔10min进行摇匀重悬。5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液包括：在混合溶液中添加PVPP崩解剂后，在200～300rpm、20～30℃的条件下震荡10～15min，将混合溶液在0～5℃环境下离心25～30min得到第一沉淀物和第一上清液。6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液包括：对所述第一上清液采用0.22μm的滤膜进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊亚，魏源送，李萍，辛苑，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：