本发明专利技术公开了经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基质蛋白基因MN表达得到的经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述狂犬病病毒为狂犬病病毒（rabies virus，RV）HEP-Flury株。利用上述修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株基质蛋白基因MN构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒基质蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学和生物
更具体地，涉及一种修饰的抗狂犬病病毒 HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用。
技术介绍
狂犬病病毒（rabies virus，RV)是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经 病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属，基因组从3'端至5'端依次排列5种结构蛋白，即核蛋白 (N)、基质蛋白（M)、憐酸蛋白（P)、糖蛋白（G)和转录酶蛋白（L)。其中基质蛋白为狂犬病 病毒最小的结构蛋白，共202个氨基酸，占病毒总蛋白的11%。M蛋白能够连接核衣壳和病 毒膜，在1~72位氨基酸残基之间有一个抗原决定簇，该部位与狂犬病病毒的免疫反应有 关。另外，由于糖蛋白的羧基端插入其中，因此它可以直接影响糖蛋白在病毒包膜表面的构 型，在病毒形态形成中都起着重要作用，并且平衡、调节病毒的转录与复制。因此，M蛋白是 检测狂犬病病毒的很好的一个靶点。 M蛋白的表达纯化是抗体制备的前提，合理的基因修饰可以实现蛋白的高效表达。 但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因（基因的序列和性质等具有差别），如何修 饰基因，确定修饰位点及修饰数量，致使其与表达菌的偏嗜性匹配，以提高蛋白的表达量； 表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇 诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以 及活性的测定等均有较大的差异，需要形成一个稳定的、完整的技术方案，才能从根本上解 决M蛋白的高效表达和成本问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有狂犬病病毒M蛋白表达技术的不足，提供一 种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因 MN，利用该修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株基质蛋 白基因 MN构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识 别狂犬病病毒基质蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试 验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。 本专利技术上述目的通过以下技术方案实现： 一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因丽，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 -种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白，由上述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基 因 MN表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 -种表达载体，该载体含有上述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因 MN。 由上述表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白在制备抗狂犬病病毒M蛋白的 单克隆抗体中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。 -种抗狂犬病病毒M蛋白的抗体，采用的免疫原是上述含经修饰的狂犬病病毒的 基质蛋白基因 MN的表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白。 进一步地，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。 更进一步地，所述抗体为单克隆抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，所用抗体是以经 修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，所 用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，所用抗体 是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 本专利技术构建全长含经修饰优化的狂犬病病毒H印-flury株M蛋白基因的原核表达 质粒pET-MN，在大肠杆菌中表达丽重组蛋白，并以此为基础制备抗M蛋白单克隆抗体，为 MN单克隆抗体在间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫焚光试验检测狂犬病 病毒的应用创造条件 本专利技术中优化的MN基因的获得是运用RaCC及CAI Calculator软件对狂犬病病 毒HEP-Flury株M蛋白基因序列进行分析，发现M基因序列中共含有大肠杆菌稀有密码子 20个，其中，仅编码精氨酸（Arg)的稀有密码子agg，aga，cga就有13个，且在第77、78位 出现连续成串的情况，CAI (codon adaptation index，密码子适应指数）亦较低，仅0.652， 构建完成的PET32-M在优化条件下表达的目的蛋白量仅占菌体总蛋白15~17%。经分 析后，综合考虑密码子偏嗜性、mRNA起始区的二级结构稳定性等因素，对其全序列进行同 义密码子的替换。于两端分别引入Kpn I和Hind III酶切位点（由Invitrogen公司合 成），继而PCR扩增MN，连接于pMD18-T Simple载体，得到携有优化后序列的质粒pMD-MN， 再与pET-32a(+)表达载体的Kpn I和Hind III双酶切反应，回收产物并且连接成功构建 pET-MN重组表达载体，重组质粒DNA序列测定结果证实了含有目的基因。将重组表达载体 转化DH5a感受态细胞，筛选得到的阳性重组子鉴定正确后提取质粒转化BL21(DE3)感受 态细胞进行IPTG诱导表达，诱导表达后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表 达后，经过纯化后成功得到表达产物M蛋白，相对分子质量39kDa。 本专利技术采用用原核表达载体pET-32a表达狂犬病毒H印-Flury弱毒株M蛋白，纯 化后免疫BALB/c雌性小鼠，得到能够稳定分泌特异性McAb的细胞株，制备腹水并进行特异 性检测、抗体效价检测及亚型鉴定。结果显示，改造前后的M序列在pET-32a载体中都能够 得到大量表达，并经Western-blotting、质谱鉴定分析正确，但改造后的M序列较未改造序 列表达量得到明显的提高；该蛋白免疫BALB/c小鼠融合后筛选所得细胞株多次传代仍能 够稳定分泌特异性McAb，经鉴定为IgGl ( κ )亚型，由其制备的腹水抗体效价在50 000~ 100 000以上，与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒II 型和犬钩端螺旋体无交叉反应。该McAb特异性显著、与抗原结合能力强，为狂犬病的检测、 治疗及对狂犬病病毒M蛋白的进一步深入研宄提供了良好的基础。 本专利技术采用的抗原（M重组蛋白）为可溶性抗原，加之融合时采用了 6块96孔细胞 培养板进行培养，因此，首选了具有快速、简便、高通量、结果简单明了等优势的ELISA法。 摸索适宜的ELISA条件时所得结果显示，选用的包被抗原具有良好的特异性，筛选时所得 结果显示，阴性、阳性结果清晰明了，阴性值0D450 < 0. 03,阳性值0D450彡0. 1，差异显著， 效率高，因此，该间接ELISA方法对杂交瘤细胞的筛选工作有着重要的作用。 本专利技术中免疫、包被抗原为融合表达的M蛋白，其中存在大量非RV基质蛋白的部 分，如标签蛋白His、trx等载体自身的蛋白，若仅对杂交瘤细胞进行粗略的筛选有可能会 得到假阳性，即所得单克隆抗体针对的为载体本身所表达蛋白的抗原位点而不是基质蛋白 上的抗原位点。因此，本专利技术在初步筛选后采用双筛选法对所有疑似阳性结果进行了进一 步的检测，包被抗原采用融合蛋白M、pET32a空载体蛋白P、融合表达的其他蛋白G，若样品 对P、G蛋白呈阳性反应则判为对基质蛋白阴性。结果显示，初步筛选阳性样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭霄峰，何飞龙，江飙，田钦，梅明珠，杨先锋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。