EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，至少包括一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体；所述质控线含有生物素；一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。本发明专利技术的检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点。

【技术实现步骤摘要】
EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种抗体检测试剂。本专利技术还涉及包含该检测试剂的试剂盒及制备方法。
技术介绍
EB病毒(epstein-barrvirus,EBv)，又称人类疱疹病毒4型(Humanherpesvirus4(HHV-4))。Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。EB病毒分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。EB病毒与鼻咽癌关系十分密切,EB病毒在感染过程中形成的病毒特异抗原可以区分为早期抗原(EA)、病毒衣壳抗原(VCA)、核相关肿瘤抗原(EBNA)和膜抗原(MA)。检测这些抗原的相应抗体反应，有助于EBV相关疾病的诊断和治疗。病毒衣壳抗原(VCA)具有很强的免疫原性，最初感染EBV的患者血清中可检测到VCA-IgM，之后IgM抗体逐渐减少到无法检出的水平，几乎同时VCA-IgG逐渐增加，并可在正常人体内终生存在。若此试验阴性，可以排除EBV感染。核相关肿瘤抗原(EBNA)可分为六种，其中NA1抗原是唯一一种在所有EB病毒相关肿瘤细胞中都表达的病毒蛋白，出现在所有持续受感染细胞的核中，其免疫原性表达相对迟些，仅数周或数月后形成抗NA1抗体。一个明显阳性试验结果(第二滴度阶段)显示曾有过感染。若VCA试验阳性，滴度为1：160或更高，结合阴性或弱阳性的抗EBNA1试验，就表示一种急性、新的或复发感染。因此，EB病毒NA1抗原的检测对于鼻咽癌的早期诊断和发展预后判断有非常重要的意义。目前检测EB病毒NA1-IgA的检测试剂主要是采用酶联免疫吸附(ELISA)法、Real-time定量PCR法等，但存在操作复杂、检测灵敏度较低、检测时间长的缺陷。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。胶体金法检测试剂将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。中国专利申请CN101949932A提供了一种胶体金法检测EB病毒IgA抗体的检测试剂，其采用EB病毒NA1抗原包被检测线，鼠抗人IgA单抗标记胶体金，用羊抗鼠IgG抗体包被质控线。中国专利申请CN102539768A提供了一种EB病毒ZtaIgA抗体胶体金检测试剂，其采用EB病毒Zta抗原包被检测线，鼠抗人IgA单抗标记胶体金，用羊抗鼠IgG抗体包被质控线。以上两种胶体金法检测试剂均采用EB病毒抗原包被检测线，检测线的抗原可与检测样本中的EB病毒IgG、IgA、IgM等所有抗体反应，由于IgG是血清中免疫球蛋白主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％，是检测目标IgA抗体的4～7倍，可严重竞争干扰检测目标IgA与包被EB病毒抗原的结合，造成检测结果灵敏度与特异性降低。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，用鼠抗人IgA单克隆抗体划检测线，并引入生物素-亲和素系统，直接捕获检测样本中的全部IgA抗体，可以有效的避免IgG、IgM等抗体的干扰，提高检出的灵敏度与特异性。本专利技术的另一个目的在于提供一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂盒。本专利技术还提供所述检测试剂的制备方法。根据本专利技术的一方面，一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，至少包括一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体；所述质控线含有生物素；一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，其中优选地，所述检测线以包被浓度为1.4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线，所述质控线以包被浓度为2.2mg/ml的生物素划线，所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为25μg/ml，所述生物素标记的重组EB病毒NA1抗原中生物素的标记浓度为30μg/ml。所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，进一步包括一用于加载检测样品的样品垫。根据本专利技术的另一方面，提供一种检测试剂盒，其包括所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，以及与之同时提供的相关使用说明、辅助检测工具、试剂和/或商品销售信息。根据本专利技术的再一方面，提供制备权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂的方法，包括：1)划线NC膜的制备：用包被浓度的鼠抗人IgA单克隆抗体在NC膜上划检测线；用包被浓度的生物素在NC膜上划质控线；2)金标垫的制备：将标记浓度的亲和素与胶体金偶联制备胶体金标记的亲和素复合物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备金标垫；3)抗原垫的制备：将标记浓度的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备抗原垫。本专利技术所述的方法，优选地包括下述步骤：(1)划线NC膜的制备：用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为1.4mg/ml，将生物素稀释成包被浓度为2.2mg/ml，用金标划线机将两种包被液划到NC膜上，干燥后保存备用；(2)金标垫的制备：将标记浓度为25μg/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体金标记的亲和素复合物，以转速为10000转/分钟离心30分钟，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的80％，然后用稀释液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干燥后保存备用；(3)抗原垫的制备：将标记浓度为30μg/ml的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，将混合液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成抗原垫，干燥后保存备用；(4)切割装配：将划线NC膜、金标垫、抗原垫、吸水纸、样品垫装配成反应板，再用切条机切成4mm的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EB病毒NA1‑IgA抗体检测试剂，至少包括一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体；所述质控线含有生物素；一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。

【技术特征摘要】
1.一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，组成为一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体；所述质控线含有生物素；一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物；一用于加载检测样品的样品垫；一粗纤维滤纸；其中所述检测线以包被浓度为1.4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线，所述质控线以包被浓度为≥2.2mg/ml的生物素划线，所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为30～40μg/ml，所述生物素标记的重组EB病毒NA1抗原中生物素的标记浓度为25～30μg/ml。2.一种检测试剂盒，其包括权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂。3.制备权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂的方法，由以下步骤组成：(1)划线NC膜的制备：用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为1.4mg/ml，将生物素稀释成包被浓度为≥2.2mg/ml，用金标划线机将两种包被液划到NC膜上，干燥后保存备用；(2)金标垫的制备：将标记浓度为30～40μg/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体金标记的亲和素复合物，以转速为10000转/分钟离心30分钟，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的80％，然后用稀释液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干燥后保存备用...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐安洲，王胜岚，叶为民，张哲，宋小冬，李峰，
申请(专利权)人：中山生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44