一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法技术

本申请提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，以鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，使用AIE荧光微球免疫层析方法全程定量检测胱抑素C比传统方法更敏感，测定范围更宽广，本发明专利技术提供的方法提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为10分钟，大大提高了诊断效率，使用AIE荧光微球偶联到抗体表面的羧基基团，单个抗体可结合多个AIE荧光微球，可放大产生的荧光信号，具有高灵敏度。具有高灵敏度。具有高灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于体外诊断免疫层析检测领域，尤其是涉及一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清中。

技术介绍

[0002]胱抑素C(CYS
‑
C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ
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微量蛋白及γ
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后球蛋白，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质。当肾功能受损时，CYS
‑
C在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，CYS
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C在血液中浓度可增加数倍甚至十数倍。CYS
‑
C水平不受性别、年龄、饮食等因素的影响，是一种反映肾小球滤过率(GFR)变化的理想内源性标志物，所以胱抑素C的检测在临床评价肾脏功能、肾脏损害、肾移植等方面有重要应用价值。
[0003]临床检验中胱抑素C的检测多以生化免疫比浊法为主，该方法适合于批量检测但需要大型仪器，而免疫层析法由于检测快速且不需要大型仪器，在临床检验中占据一席之地。目前胱抑素C免疫层析试剂也有胶体金法，检测快速但灵敏度不够、线性窄、特异性较差，无法精确的监测血液中的胱抑素C含量的变化来监测肾脏功能。
[0004]因此，亟需一种特异性高、灵敏度强的胱抑素C试剂盒及其制备方法来解决上述问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决现有技术无法做到的技术问题，提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
[0007]为实现上述第一个目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫中含有AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
[0009]所述检测线上包被有鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ，所述质控线上包被有鸡IgY抗体；
[0010]所述标记用的AIE荧光微球为长沙美牛科技有限公司粒径为200nm的AIE荧光微球。
[0011]优选的，所述AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)将AIE荧光微球加入至MES溶液中，溶解后定容至浓度30～100ul/ml，得AIE荧光微球存储液，将AIE荧光微球存储液与化学交联剂混合后，以MES缓冲液作为反应介质，25℃培育30～120min，得到活化后的AIE荧光微球存储液，更优选的，化学交联剂选用零键桥
交联剂EDC，该试剂是生物耦合中最小的可利用试剂体系，它通过形成一个不含其它原子的键合介导两个分子之间的生物耦合，这其中一个分子中的一个原子共价的附着于另一个分子的一个原子，它们中间没有介入任何交联剂或间隔基。在本专利技术的一个优选技术方案中，采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化；
[0013](2)将步骤(1)中活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES缓冲液；
[0014](3)取步骤(2)中第一次重悬后的AIE荧光微球存储液分别加入鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY，20
‑
25℃反应60min，并加入500ul的3％酪蛋白，封闭30min；
[0015](4)封闭结束后离心，离心条件为15000rpm，20min，25℃；用Tris
‑
HCl缓冲液对离心后的标记液进行洗涤，离心条件为12000rpm，15min，25℃，重复2
‑
3次，最后一次离心条件为15000rpm，20min，25℃，去上清后，得AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体。
[0016]优选的，所述化学交联剂为EDC、NHS、琥珀酸酐和戊二醛中的一种或多种。
[0017]优选的，所述Tris
‑
HCl缓冲液中含有1
‑
5％的蔗糖及0.05
‑
0.1％的表面活性剂。
[0018]优选的，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X
‑
100中的任意一种。
[0019]优选的，所述AIE荧光微球与所述鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ的质量比为(30～100)ul:(5
‑
50)ug；所述AIE荧光微球与所述羊抗鸡IgY的反应比例为(30～100)ul:(5
‑
50)ug；所述AIE荧光微球为活化前的AIE荧光微球。
[0020]为了实现上述第二个目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0021]一种如上任一项所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0022]a.抗体的标记：使用AIE荧光微球标记鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体；
[0023]b.将步骤a中AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体使用复溶液分别按比例稀释定容；
[0024]c.包被抗体：将检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和质控抗体鸡IgY溶解于0.1
‑
1M的Tris
‑
HCl缓冲液中；检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ的包被浓度为0.8g/ml～1mg/ml，质控抗体鸡Ig的包被浓度为0.5mg/ml～1mg/ml；
[0025]d.划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16
‑
18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[0026]e.结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3
‑
8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[0027]f.样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[0028]g.组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘
贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2
‑
3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2
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3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，其特征在于：所述结合垫中含有AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；所述检测线上包被有鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ，所述质控线上包被有鸡IgY抗体；所述标记用的AIE荧光微球为长沙美牛科技有限公司粒径为200nm的AIE荧光微球。2.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)将AIE荧光微球加入至MES缓冲液中，溶解后定容至浓度30～100ul/ml，得AIE荧光微球存储液，将AIE荧光微球存储液与化学交联剂混合后，以MES缓冲液作为反应介质，25℃培育30～120min，得到活化后的AIE荧光微球存储液；(2)将步骤(1)中活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES缓冲液；(3)取步骤(2)中第一次重悬后的AIE荧光微球存储液分别加入鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY，20
‑
25℃反应60min，并加入500ul的3％酪蛋白，封闭30min；(4)封闭结束后离心，离心条件为15000rpm，20min，25℃；用Tris
‑
HCl缓冲液对离心后的标记液进行洗涤，离心条件为12000rpm，15min，25℃，重复2
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3次，最后一次离心条件为15000rpm，20min，25℃，去上清后，得AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体。3.根据权利要求2所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述化学交联剂为EDC、NHS、琥珀酸酐和戊二醛中的一种或多种。4.根据权利要求2所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述Tris
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HCl缓冲液中含有1
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5％的蔗糖及0.05
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0.1％的表面活性剂。5.根据权利要求4所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X
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100中的任意一种。6.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述AIE荧光微球与所述鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ的质量比为(30～100)ul:(5
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50)ug；所述AIE荧光微球与所述羊抗鸡IgY的反应比例为(30～100)ul:(5
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50)ug；所述AIE荧光微球为活化前的AIE荧光微球。7.一种如权利要求1
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6任一项所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.抗体的标记：使用AIE荧光微球标记鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体；b.将步骤a中AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王胜岚，彭永林，李峰，张代玉，
申请(专利权)人：中山生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：