本发明专利技术公开了一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe3O4磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe3O4磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。由上述检测试纸和过氧化物酶底物显色液构成用于检测森林脑炎病毒抗体的检测试剂盒。该试剂盒能有效检测森林脑炎病毒抗体，检测结果稳定、可靠、特异性强、灵敏度高，比一般胶体金检测试纸灵敏度高10-100倍，操作简单，不需要检测仪器，通过肉眼即可得到检测结果。
【技术实现步骤摘要】
森林脑炎抗体的检测试纸、试纸制备方法及其检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测试剂领域，特别涉及一种森林脑炎抗体的检测试纸、试纸的 制备方法及其检测试剂盒。
技术介绍
目前针对森林脑炎病毒抗体的检测技术主要是ELISA、化学发光等免疫学方法，其 中，ELISA检测方法需要反复清洗、拍板，并要求风光光度仪器进行吸光度的检测；化学发 光法中需要的荧光试剂比较昂贵，检测需要特定的荧光分析仪器；这些方法需要昂贵的仪 器，操作繁琐，并且整个检测过程耗时长，还要求检测人员具有一定的专业素质。 ELISA、化学发光等免疫学检测方法最关键的一个因素是抗原抗体的选择，如果直 接采用森林脑炎病毒培养液制备抗原，存在抗原成分复杂、有效抗原的含量低、杂蛋白多、 免疫原性差以及生物安全风险性高等问题，而且用于免疫学检测时，容易导致阳性结果。 另外，胶体金检测方法适合现场检测，但检测灵敏度受到限制，主要是由于胶体金 连接了待标记抗体或待标记蛋白之后，很不稳定，很容易因电荷的变化使得抗体脱离，造成 每个胶体金的标记抗体量大大减少，从而造成灵敏度的降低。并且，胶体金试剂的制备采用 氯金酸，试剂成本比较高，导致免疫层析试纸的总体成本比较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测森林脑炎抗体的检 测试纸、试纸的制备方法及其检测试剂盒。该检测试剂盒不需要专业技术人员即可完成检 测工作，也不需要专门的检测仪器即可判断检测结果，并且该检测试剂盒具有较高的灵敏 度。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： -种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe304磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素 膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe304磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡 萄球菌A蛋白（SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质 控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。 如上所述的检测试纸，优选地，所述Fe304磁性纳米颗粒的粒径为5nm?500nm。 如上所述的检测试纸,优选地，所述森林脑炎抗原的基因序列如SEQIDN0. 1所示。 如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法,优选地，该方法包括： (1)、利用森林脑炎抗原的基因序列如SEQIDNO. 1所示，制备森林脑炎抗原； (2)、SPA标记羧基化处理的Fe304磁性纳米颗粒，喷涂于玻璃纤维膜上，制备Fe304 磁性纳米颗粒载体垫； (3)、包被硝酸纤维素膜，将步骤（1)获得的森林脑炎病毒重组蛋白抗原和羊抗兔 IgG分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带； (4)、处理样品垫； (5)、试纸条的组装：将步骤（4)处理后的样品垫、步骤（2)SPA标记的Fe304磁性纳 米颗粒载体垫、步骤（3)包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，获得森林脑炎 抗体检测试纸。 如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，优选地，所述步骤（4)处理样品垫 步骤为：将含有体积比0.5%?2%的吐温20、pH= 7. 2?7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘 干或自然干燥后待用。 如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，优选地，所述步骤（5)中吸水垫为 吸水纸或纯棉绒浆滤纸。 一种森林脑炎病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒包括,如上所述的检测试纸和辣根 过氧化物酶底物。 如上所述的检测试剂盒，优选地，所述辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺（0PD)体 系、四甲基联苯胺（TMB)体系、3. 3 -二氨基联苯胺（DAB)体系或2, 2'-边氮基-双3-乙基 苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)体系中的任一种。 上述的辣根过氧化物酶底物的体系当中均含有过氧化氢。 如上所述的检测试剂盒，优选地，所述四甲基联苯胺体系包括：四甲基联苯胺和过 氧化氢，所述四甲基联苯胺的质量浓度为〇. 〇lmg/ml?10mg/ml，所述过氧化氢的摩尔浓度 为 0? 25mmol/L?L2mmol/L〇 如上所述的检测试剂盒，优选地，所述四甲基联苯胺体系配制方法如下：a)先将 四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，再将加入蒸馏水定容，获得A液； b)先配制质量浓度为0. 5%?30%的过氧化氢尿素溶液，之后称取柠檬酸、磷酸 氢二纳，加入过所述氧化氢尿素溶液，用蒸馏水定容，所述柠檬酸的终浓度为〇.lmol/L、所 述磷酸氢二纳的终浓度为〇. 2mol/L，所述过氧化氢尿素的摩尔浓度为0. 5mmol/L?2. 4m mol/L，获得B液； c)将上述A液与B液等体积混合获得TMB应用液备用。 本专利技术提供一种森林脑炎病毒抗体的检测试纸，首先制备获得一种森林脑炎病毒 的重组抗原蛋白；其次将四氧化三铁磁性纳米颗粒经羧基化修饰后，再进行SPA的标记， 标记后形成免疫磁珠，该免疫磁珠比较稳定，能有效结合待检的目标物，不会导致假阴性结 果，从而避免出现漏检；利用制备的重组抗原蛋白和SPA标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒 制备森林脑炎病毒抗体免疫层析检测试纸。 利用制备的森林脑炎病毒抗体免疫层析检测试纸，进行样品的检测，判断结果时， 最后加入TMB应用液，增强结果的显色功能。主要是利用Fe304磁性纳米颗粒具有辣根过氧 化物酶的催化特性，加入辣根过氧化物酶的底物显色反应后，判断检测结果，底物通过四氧 化三铁的催化作用，使检测条带的颜色加深，极大地放大反应效果，灵敏度大大提高，可比 胶体金检测灵敏度高10-100倍的数量级，且不需要检测仪器进行结果的判定。 采用TMB作为显色底物时，只需要添加本专利技术配置的一种TMB应用液就可实现显 色反应，比常规应用TMB溶液显色需要分别添加A液、B液使用方便，节省时间，且不需要用 现用现配。 本专利技术制备的森林脑炎病毒抗体检测试剂盒，试剂成本低，检测试剂溶液稳定、特 异性强、灵敏度高、比胶体金检测结果灵敏度高10-100倍，检测结果准确可靠，操作简单， 不需要较强的专业技术就可以操作，通过肉眼观察来判断检测结果，并不需要仪器进行判 断，使用方便。 【附图说明】 图1是本专利技术重组质粒的阳性克隆的电泳结果图。 图2是本专利技术森林脑炎病毒重组蛋白表达SDS-PAGE电泳图。 图3是本专利技术森林脑炎病毒抗体的检测试剂盒的检测结果。 图4是胶体金免疫层析试纸检测结果。 【具体实施方式】 目前在生物技术检测方面，有利用四氧化三铁纳米颗粒进行检测的应用，主要是 利用其具有磁响应性的功能，对待检目的物进行富集分离的，可有效提高检测率。四氧化 三铁纳米颗粒还具有辣根过氧化物酶催化底物变色的特性，但是利用这个特性进行ELISA 检测鲜有报道，主要原因可能是一方面考虑到由于四氧化三铁纳米颗粒的量子化尺寸效应 等，使它对某种波长的光吸收带有蓝移现象，并对各种波长光的吸收有宽化现象，认为对 ELISA检测需要测量吸光度值不是很准确；另一方面，由于四氧化三铁本身具有的颜色，会 对后续测定吸光度值有影响，所以认为利用四氧化三铁纳米颗粒具有辣根过氧化物酶的特 性进行免疫学方法的检测，尤其是ELISA检测，结果不是很准确、可靠，有一定的技术偏见。 本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe3O4磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe3O4磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。
【技术特征摘要】
1. 一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe304磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、 吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe304磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄 球菌A蛋白（SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控 带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。2. 如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述Fe304磁性纳米颗粒的粒径为 5nm ?500nm〇3. 如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述森林脑炎抗原的基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。4. 一种森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，该方法包括： (1) 、利用森林脑炎抗原的基因序列如SEQ ID NO. 1所示制备森林脑炎抗原； (2) 、SPA标记羧基化处理的Fe304磁性纳米颗粒，喷涂于玻璃纤维膜上，制备Fe30 4磁性 纳米颗粒载体垫； (3) 、包被硝酸纤维素膜，将步骤（1)获得的森林脑炎病毒重组蛋白抗原和羊抗兔IgG 分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带； (4) 、处理样品垫； (5) 、试纸条的组装：将步骤（4)处理后的样品垫、步骤（2)SPA标记的Fe304磁性纳米颗 粒载体垫、步骤（3)包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，获得森林脑炎抗体 检测试纸。5. 如权利要求4所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤（4)处 理样品垫步骤为：将含有体积比0. 5%?2%的吐温20、p...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇，韩辉，曾婷婷，赵婷婷，王静，徐宝梁，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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