抗流感病毒中和抗体及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种抗流感病毒抗体，并提供了生产它的方法，和用于确定受试对象是否携带该中和抗体的检测方法。所述抗体即使是在根据血凝素氨基酸的保守性而分类的两组流感病毒之间，也超越组间的障碍而具有中和活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗流感病毒中和抗体及其筛选方法[
]本专利技术涉及一种抗流感病毒抗体，其超越了亚型之间的障碍，对所有流感病毒均显示普遍的中和活性，并涉及生产该抗体的方法和用于检测受试对象中该抗体的方法。[
技术介绍
]流感病毒是一种RNA包膜病毒，颗粒直径为大约100nm，属于正粘病毒科。根据其内在蛋白的抗原性可以分成3型：甲型（A型）、乙型(B型)和丙型(C型)。流感病毒由被具有脂质双层结构的病毒包膜所包围的内部核衣壳或者与核蛋白会合的核糖核酸(RNA)核心，以及外部糖蛋白构成。病毒包膜的内层主要由基质蛋白形成，而外层大多由宿主来源的脂质形成。流感病毒的RNA呈现分节结构(segmentarystructure)。全球范围内蔓延的流感是由甲型流感病毒导致的。甲型病毒具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种包膜糖蛋白。根据抗原性不同，HA分为16种亚型，而NA可分成9种亚型。近年来，高致病性的H5N1型禽流感病毒在全球猛烈蔓延；这样的状况，即使什么时候出现了人感染人的新型病毒，并引起大流行，也不会令人感到奇怪。为了应对这种情况，全球病毒检测系统正在被加强，大量储备达菲(Tamiflu)等治疗药物，疫苗的开发、生产和大量储备也正在进行。然而，情况是许多问题依然未被阐明，包括这样的病毒何时以及以什么形式出现，那时达菲等是否有治疗效果，所开发的疫苗是否有效，何时以及向谁接种，何时开始高预警状态以及何时宣告解除该状态。这是因为，我们要迎来要针对尚未出现的病原菌和病毒来准备疫苗和治疗药物这样的人类从未经历过的情况。特别地，疫苗开发因为如下事实而存在问题，即流感病毒基因组中，每年会在血凝素基因中导入很多突变，导致抗原漂移（抗原性改变），这被认为是疫情流行的原因所在。因此，接种与正在流行的型不匹配的疫苗不具有预期的预防效果。之所以不尝试开发流感病毒的抗体治疗药物（预防药物）的原因即在于，担心在开发期间本来可以被中和的病毒通过抗原漂移改变其特征，而导致通过巨大努力开发的药物不再有用。本专利技术人们针对在1968-2004年间分离的12个H3N2型流感病毒株，筛选了由采集自单个个体的大量B淋巴细胞制作的噬菌体展示人抗体文库，结果发现，大部分显示中和活性的克隆是抗血凝素抗体，并且它们可以被粗略分为三组：特异性中和在1968-1973年间分离的病毒株的抗体，特异性中和在1977-1993年间分离的病毒株的抗体，或特异性中和在1997-2003年间分离的病毒株的抗体（非专利文献1）。尽管这一发现打破了传统的开发用于流感病毒的抗体治疗药物（预防药物）没有意义的普遍认识，但是迄今为止噬菌体抗体文库尚未被严肃地加以研究，因为重链和轻链的组合不一定反应生物体内情况等原因。在这种状况下，三个研究组独立地成功分离了可以中和H5型流感病毒的人单克隆抗体（专利文献1和2，非专利文献2-4）。这些抗体不仅对H5型流感病毒，而且对其它亚型（例如H1型等）也具有中和活性。然而，尽管根据表位可以将血凝素的16种亚型（H1-H16）分成两个大组（组1和2），这些抗体仅对其中的组1（例如H1,H2,H5,H6,H8,H9型等）显示中和活性，对属于组2的流感病毒（例如H3和H7型等）不显示中和活性。也就是说，可超越基于血凝素的序列而划分的两个组之间的障碍，发挥广泛的中和活性的抗流感病毒抗体，至今尚没有分离、报告。X-射线结构分析显示了这些抗体与血凝素的结合模式，可以显见，血凝素的38位氨基酸在组2的H3和H7型中变成了天冬酰胺，经历N型糖链修饰（非专利文献4和5）。而且，已有报道，H5的38位引入N型糖链修饰位点，会导致中和抗体的结合能力下降70%（非专利文献5）。还已知，当在血凝素中产生了突变的流感病毒逃离中和抗体时，这些突变主要集中在据报道含有中和表位的血凝素基因内的5个区域（A、B、C、D和E区）（非专利文献6和7）。这些发现提示，获得可以超越两组之间障碍的中和抗体是很困难的。[现有技术文献][专利文献][专利文献1]WO2007/134327[专利文献2]WO2008/028946[非专利文献][非专利文献1]VirologyVol.397,pp.322-330,2010[非专利文献2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.105,pp.5986-5991,2008[非专利文献3]PLoSONE,Vol.3,pp.5986-5991,e3942,2008[非专利文献4]NatureStructural&MolecularBiology,Vol.16,pp.265-273,2009[非专利文献5]Science,Vol.324,pp.246-251,2009[非专利文献6]Nature,Vol.289,pp.373-378,1981[非专利文献7]J.Gen.Virol.,Vol.62,pp.153-169,1982[专利技术概要][本专利技术所要解决的问题]在准备应对预计在不久的将来发生的H5N1型流感的大流行以及随后很可能发生的H7和H9型病毒所致的大流行中，高度需要代替预测抗原性的变化来设计疫苗这样的传统的针对流感的预防概念，开发出基于更普遍、更可靠的新概念的预防手段。因此，本专利技术的目的是提供抗流感病毒抗体，其发挥超越根据血凝素蛋白的氨基酸序列的保守性而分类的2组之间的障碍的中和活性，优选的是提供对H1-H16型的所有的亚型的流感病毒均具有中和活性的抗体，并提供制备该抗体的方法。此外，本专利技术的另一个目的是提供一种检测方法，其能够简单地并且相对廉价地考察受试对象是否携带上述通用的中和抗体。[解决问题的方法]本专利技术人使用单采血液成分术（apheresis）（分离采集血液中的一种组分），从单个个体采集了109个这样大量的B淋巴细胞，制作了反映几乎全部抗体谱的噬菌体展示人抗体文库，使用已灭活的H3N2流感病毒作为抗原，通过淘选法（panningmethod），网罗性地筛选了结合该抗原的抗体克隆。从选出的噬菌体回收抗体，测试其对属于组2的H3型流感病毒和属于组1的H1型、H2型和H5型流感病毒的中和活性。结果，令人惊讶地发现，成功获得了40个以上的克隆的下述抗体，所述抗体不仅对用作筛选抗原的H3型显示中和活性，而且对属于和H3型所属不同组的H1型、H2型和H5型流感病毒，也显示中和活性。这些克隆具有6种不同的重链可变域（VH）氨基酸序列，但对所有这些序列进行了IgBLAST检索，结果判断出它们全部属于VH1-69种系（germline）。而且，IgBLAST检索显示，这6种克隆所具有的轻链可变域（VL）限定为3种种系。考虑到先前报道的针对H5型的中和抗体是利用VH1-69或者相似的VH1-e，以及X-射线结构分析所显示的该中和抗体与血凝素的结合模式，本专利技术人所获得的抗体能够中和H3型流感病毒是非常令人意外的事情。然而，本专利技术人想到，在检索可以中和与抗原所属不同组的病毒亚型的抗体时，通过彻底性地筛选与某种作为抗原的亚型相互反应的抗体，可能获得能够超越组间障碍、中和所有流感病毒亚型的抗体。因此，本专利技术人从一个个体采集了109个B淋巴细胞，比传统惯例大两个数量级，并生成了几乎完全反映供体抗体谱的人抗体文库，网罗性地筛选可以结合H3型流感病毒的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.03 US 61/380,051;2011.03.15 US 61/452,785;1.一种分离抗体，其中重链可变域为序列号11中所示的氨基酸序列并且轻链可变域为序列号23中所示的氨基酸序列，或者其中，所述重链可变域为序列号15中所示的氨基酸序列并且所述轻链可变域为...

【专利技术属性】
技术研发人员：黑泽良和，伊庭善孝，大岛信子，奥野良信，
申请(专利权)人：学校法人藤田学园，一般财团法人阪大微生物病研究会，
类型：
国别省市：