一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体检测中的应用。通过原核表达发热伴血小板减少综合征病毒NP蛋白，制备针对NP蛋白的鼠源单抗或多抗。通过酶联免疫吸附法检测NP蛋白来测定确定病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)。将待检标本与等量病毒液混合接种细胞。用NP蛋白的单抗或多抗为1抗，通过双抗体酶联免疫吸附法检测标本中和抗体效价。本发明专利技术可应用在发热伴血小板减少综合征疫苗的临床免疫效果评价、人群或动物群发热伴血小板减少综合征血清流行病学研究，以及人工制备发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的体外效价测定和评估等方面。本发明专利技术提供的方法具有敏感、快速、特异和通量高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发 热伴血小板减少综合症病毒中和抗体定量检测中的应用。
技术介绍
发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS)是我国近年来新发现的由布尼亚病毒引起的一种出血性疾病，病原称之为SFTS病 毒。本病主要分布山区和丘陵地带的农村，呈散发，人群普遍易感。临床表现为发热，体温 多在38°C以上，伴乏力、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。绝大部分患者预 后良好，但部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、 呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭死亡，重症死亡率高达15-30%。目前在我 国的河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏、浙江等地都发现了 SFTS病例。近期在日本、韩国和 美国都发现了由SFTS相关病毒引起的病例，表明病毒的分布范围较广，已成为威胁人类健 康和公共卫生的重要新发传染病。。此外，在该病毒能够感染猪、羊、牛、犬、禽等动物，对动 物健康也有潜在的威胁。 病毒的特异性中和抗体水平能够反应个体或群体的抗病毒状态，同时也常用来评 价疫苗的临床免疫效果，因此检测中和抗体具有重要的临床和流行病学意义。目前检测 SFTS病毒中和抗体方法主要是通过观察细胞病变或免疫荧光法来进行，耗时、费力、敏感性 差，而且不能同时检测大量标本。此外，SFTS病毒感染细胞（如Vero)后细胞病变不明显， 更增加了检测中和抗体的难度。NP蛋白较为保守，在病毒粒子中含量丰富。运用酶联免疫 吸附法，通过双抗体法检测病毒NP蛋白，在此基础上可以建立一种快速、敏感、可实现大量 自动检测的SFTS病毒中和抗体检测方法。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发热伴 血小板减少综合症病毒中和抗体定量检测中的应用。检测的标本包括人和动物血清、人工 制备的单抗或多抗或其它基因工程抗体。 本专利技术提供的定量检测发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的试剂盒由96孔 细胞板、Vero细胞、100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 Ig，底物 四甲基联苯胺（TMB)显色剂组成。 本专利技术所述发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的定量检测试剂盒的制备原 理： (1)原核表达发热伴血小板减少综合征病毒NP蛋白，免疫小鼠制备针对NP蛋白的 单抗或多抗； (2)采用组织细胞半数感染量（TCID50)测定病毒的滴度，通过酶联免疫吸附法检 测NP蛋白来确定细胞感染状况； (3)将待检血清倍比稀释，与等量的100TCID50病毒混合，接种细胞，在37°C，5% C02孵箱中培养20?24h ; ⑷用NP蛋白的单抗或多抗为1抗，通过双抗体酶联免疫吸附法检测标本中和抗 体效价。 上述过程所用的细胞包括Vero、BHK-21、C6/36、DH82细胞。其使用方法为： (1)抗体-病毒混合物和Vero细胞共培养：将系列倍比稀释的待检抗体和 100TCID50/50 μ L的稀释病毒液混合，放入37°C培养箱作用lh，每孔加100 μ 11. 5x104细胞 /孔的细胞，细胞培养板在37°C，5% C02孵箱中培养20?24h ; (2)固定：用PBS液洗细胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室温固定细胞 lOmin ； (3)酶标仪检测：每孔加入稀释后的NP蛋白的单抗（抗体1) 1000 μ 1，室温作用 lh，用250 μ 1/次PBS+0. 05% TWEEN-20洗涤液洗洗板4次，每孔加入100 μ 1稀释后的HRP 标记的羊抗鼠 IgG(抗体2)，室温作用lh，用250μ 1 PBS+0.05% TWEEN-20洗涤液洗涤板6 次，每孔加入ΤΜΒ底物100 μ 1，室温放lOmin显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1Μ硫酸 100 μ 1终止反应，用450纳米酶标仪读出每孔0D值； (4)结果判读：结果判定采用公式：X = (VC平均0D值一CC平均0D值）/2，Χ表示 50%的Vero细胞感染时的0D值，每孔0D值低于X值时，判定为中和抗体检测阳性，中和抗 体阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体效价。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是： (1).本专利技术根据酶联免疫吸附法原理，通过酶标记的双抗体检测NP蛋白来指示 病毒的感染情况，极大的提供了特异性和敏感性。 (2).本专利技术提供的方法，不仅可以检测人和动物血清中和抗体，也能检测人工方 法中和抗体，能够对中和抗体进行定性和定量检测。 (3).本专利技术提供的方法大大缩短了中和抗体检测时间，一般可在30小时内完成 实验。 (4).本专利技术提供的中和抗体检测试剂盒，能够高通量对标本进行检测。快速、敏 感、特异可实现大量自动检测SFTS病毒中和抗体。 (5)本专利技术可应用在发热伴血小板减少综合征疫苗的临床免疫效果评价、人群或 动物群发热伴血小板减少综合征血清流行病学研究，以及人工制备发热伴血小板减少综合 征病毒中和抗体的体外效价测定和评估等方面。 【附图说明】 图1发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体检测96孔细胞培养板布置。 【具体实施方式】 通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本专利技术。但它们不是对本专利技术的限 定。 实施例1 :NP蛋白单抗和多抗的制备 通过RT-PCR法扩增SFTS病毒NP基因，阅读框插入表达质粒pQE30 (Qiagen， Germany)的多克隆位点内，得到NP基因原核表达质粒pQE30-SFTS-NP，转化E. Coli M15菌 株（Qiagen，Germany),诱导表达6His-NP重组蛋白。NP重组蛋白纯化定量后，按常规方法 免疫BALB/c小鼠，制备抗SFTS病毒NP蛋白的单抗和多抗。 实施例2 病毒滴度测定 采用组织细胞半数感染量（TCID50)测定法。将_70°C冻存的病毒液100倍稀释。 取1 :100倍稀释的病毒液，在96孔细胞培养板上进行l/21og稀释，S卩KT2、KT 2_5、10 一3、 1〇一3 5......1〇 ―7。每孔含1〇〇 μ 1病毒液，每个稀释度做4孔重复。 取对数生长期的细胞，用LEDTA-胰酶消化，用细胞培养液分散细胞，加病毒稀释 液至10mL，用细胞计数板对细胞计数，将细胞稀释成1. 5 X 105细胞/mL备用。已稀释好病 毒的微量细胞培养板中，加100 μ 1细胞（1. 5xl04细胞/孔）。细胞培养板最好一列做正常 细胞（CC)对照。在37°C，5% C02孵箱中培养20?24h。 用PBS液（PH7. 2)的洗细胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室温固定细胞 lOmin。弃去固定液，让微量培养板室温干燥。⑴去除丙酮，用PBS洗涤微量培养板3次。 每孔加入稀释后的抗SFTS病毒NP蛋白的单抗或多抗（抗体1) 1000 μ 1，室温作用lh。用 250 μ 1/次洗涤液洗（PBS+0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒，其特征是由96孔细胞板、Vero细胞、100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig，底物四甲基联苯胺TMB显色剂组成。

【技术特征摘要】
1. 一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒，其特征是由96孔细胞板、Vero细胞、 100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 Ig，底物四甲基联苯胺TMB 显色剂组成。2. 根据权利要求1所述一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒的使用方法，其特征是由 以下步骤构成： (1)抗体-病毒混合物和Vero细胞共培养：将系列倍比稀释的待检抗体和 100TCID50/50 μ L的稀释病毒液混合，放入37°C培养箱作用lh，每孔加100 μ 11. 5x104细胞 /孔的细胞，细胞培养板在37°C，5% C02孵箱中培养20?24h ; ⑵固定：用PBS液洗细胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室温固定细胞lOmin ; (3) 酶标仪检测：每孔加入稀释后的NP蛋白的单抗1000 μ 1，室温作用lh，用250 μ 1/ 次PBS+0. 05% TWEEN-20洗涤液洗洗板...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁贤，汤奋扬，焦永军，鲍倡俊，崔仑标，李志锋，周明浩，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32