蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定和实验结果判定方法技术

本发明专利技术以利用蛋白质微阵列芯片-化学发光技术对多种自身抗体并行检测时实验结果判定为研究对象，为此类技术的实验结果判定提供了一种新思路。本发明专利技术包括：利用临界血清配制临界值一级参考品；利用临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数；利用每次实验中阳性对照品的信号值与临界值系数确定各自身抗体指标的临界值信号，并对实验结果作出判定。本发明专利技术还公开了临界值一级参考品的制备方法和临界值系数确定方法。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定和实验结果判定方法
：本专利技术属于生物芯片
，具体涉及一种用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定方法以及实验结果判定方法。
技术介绍
：随着人们对自身免疫性疾病（autoimmunediseases，AID）的研究深入，发现自身免疫性疾病累及全身各个系统，种类多达40余种，自身免病患者中，有很大一部分病人的血清或其它体液中可检测到一种或多种高效价的自身抗体，自身抗体数量达到上百种（WorldJGastroenterol，2010,16:3616-3629.）。自身抗体检测对AID的辅助诊断、病情评估、疗效监测以及预后判断均具有重要的临床应用价值。蛋白芯片微阵列技术（ProteinMicroarray）作为一种高通量、高灵敏度、特异性强、快速便捷的检测分析方法，在以自身抗体为特征的自身免疫性疾病的诊断、鉴别与筛查中得到了广泛应用，目前常见的商业化蛋白质微阵列芯片技术检测平台有FIDIS（微珠芯片）(AnnBiolClin(Pairs)2005,63:51-58.），AtheNA（微珠芯片），Luminex和Bio-Rad等公司研发的自身抗体检测系统（AnalBioanalChem,2009,393:1407-1416.）。此类芯片能同时对多个样本多个指标进行并行检测分析，产品性能与传统方法相当，但自动化程度和检测速度明显提高，标本用量减少，更加适合临床常规自身抗体的检测需求。近来年蛋白质微阵列芯片的多重新技术发展迅速，且既可用于实验室研究又可用于临床常规分析，该技术的敏感度和特异度不断得到提升（ArhtritisRheum，2005,52:2645-2655.），蛋白质微阵列芯片技术似乎是未来自身抗体分析的首选方法。利用蛋白质微阵列芯片技术检测样本所得测量值是连续的数值，临界参考值（cut-off）的确定对检测结果的判断有密切关系，也直接影响蛋白质微阵列芯片技术的灵敏度与特异度，因而临界参考值的研究在蛋白质微阵列芯片技术平台中至关重要。在自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值（cut-off）研究中，有文献报道（ClinicalChemistry,2004,50(2):416-422.），利用HumanIgG的浓度-灰度标准曲线，选取各个自身抗体指标的临界值（cut-off）范围内所有共有的最低灰度值所对应的HumanIgG的浓度作为临界值对照品的浓度，当被测样本中自身抗体指标的信号值大于临界值对照品信号值时，结果判断为阳性，反之，则结果判断为阴性。也有文献报道，通过大量健康人阴性血清检测实验，利用统计学数据处理方法，计算出每个自身抗体指标的临界信号值（cut-off），在此后的实验过程中，当某个指标的检测信号值大于该指标的临界信号值（cut-off）时，结果判断为阳性，反之，则结果判断为阴性。在这两种自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值（cut-off）研究中，前者利用HumanIgG的浓度-灰度曲线有替代各个自身抗体指标的浓度-灰度曲线是否合理，是值得商榷的。后者将每次实验过程中引入的信号波动忽略不计，这与在蛋白质微阵列芯片化学发光法实验过程中由于实验操作不能标准化、人为因素较大而导致实验信号波动较大的实事不相符合。
技术实现思路
：本专利技术要解决的问题是之一在于针对目前在利用蛋白质微阵列芯片---化学发光法技术联合并行检测多个自身抗体的实验过程中，实验结果判断方法的不足，提供一种临界值一级参考品的制备方法。本专利技术要解决的问题是之二在于提供一种利用上述临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法。本专利技术要解决的问题是之三在于针对目前在利用蛋白质微阵列芯片---化学发光法技术联合并行检测多个自身抗体的实验过程中，实验结果判断方法的不足，提供一种科学合理的实验结果判定方法，有效地消除出每次实验操作时引入的信号偏差对检测结果判断的影响，同时保证了实验结果判定的可靠性、稳定性，提高产品的灵敏度和特异度。作为本专利技术第一方面的临界值一级参考品的制备方法，由以下步骤组成：（1）选取阳性血清利用健康人阴性血清进行稀释，使稀释后的血清中每个指标在利用免疫斑点法检测，其结果为弱阳性而得到弱阳性血清；（2）对按步骤（1）中所得到弱阳性血清作进一步梯度稀释，得到2～5个浓度梯度血清；（3）对按步骤（2）中所得到的每个浓度梯度血清，进行芯片反应实验，每个浓度梯度血清重复10孔，对每个浓度梯度血清样本中各指标的信号值计算平均值标准差S样品；（4）取具有统计学意义数量的健康人阴性血清样本，进行芯片反应实验，计算阴性血清样本中各指标信号的百分位数Pr，取99分位数P值；（5）比较步骤（3）中不同浓度梯度血清各个指标的值与步骤（4）步中的Pr值，以最接近于Pr值的那个浓度梯度血清的浓度作为制备为各指标临界值参考品浓度；（6）按照步骤（5）步中确定的各指标临界值参考品浓度，选取阳性血清，用健康人阴性血清进行稀释制备临界值一级参考品。在上述临界值一级参考品的制备方法中，所述步骤（1）和步骤（6）中的阳性血清为Jo-1、SSA、SSB、Sm、Scl-70、RNP自身抗体指标阳性的血清中的一个或多个。在上述临界值一级参考品的制备方法中，所述步骤（2）中，得到4个浓度梯度血清；所述步骤（5）中是比较步骤（3）中4个浓度梯度血清各个指标的值与步骤（4）步中的Pr值。作为本专利技术第二方面的利用上述临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法，具体由以下步骤组成：（1）选用阳性对照品作为待测样本，进行芯片反应实验，重复反应10孔，计算阳性对照品的各个指标信号值平均值（2）选用临界值一级参考品作为待测样本，进行芯片反应实验，重复反应2孔，计算临界值一级参考品的各个指标信号值平均值（3）利用下述公式求取指标临界值系数作为本专利技术第三方面的用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的实验结果判定方法，其是以利用蛋白质微阵列芯片---化学发光技术对多种自身抗体并行检测时实验结果判定为研究对象，利用“临界值公司一级参考品”确定阳性对照品中各自身抗体指标的“临界值系数”，再利用每次实验中阳性对照品的信号值与“临界值系数”确定各自身抗体指标的临界值信号，并对实验结果作出判定。上述用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的实验结果判定方法的具体步骤如下：（1）临界值一级参考品的制备步骤；（2）利用步骤（1）制备的临界值一级参考品，采用具有统计学数据处理方法，给阳性对照品中各自身抗体指标确定临界值系数步骤；（3）在每次实验中，利用阳性对照品中的各指标信号值与对应的各指标的临界值系数确定此次实验中各指标的临界值信号，并对实验结果作出判定步骤。所述临界值一级参考品的制备步骤由以下步骤组成；（1a）选取阳性血清利用健康人阴性血清进行稀释，使稀释后的血清中每个指标在利用免疫斑点法检测，其结果为弱阳性而得到弱阳性血清；（1b）对按步骤（1b）中所得到弱阳性血清作进一步梯度稀释，得到2～5个浓度梯度血清；（1c）对按步骤（1b）中所得到的每个浓度梯度血清，进行芯片反应实验，每个浓度梯度血清重复10孔，对每个浓度梯度血清样本中各指标的信号值计算平均本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法，其特征在于具体由以下步骤组成：(1)临界值一级参考品制备(1.1)选取阳性血清利用健康人阴性血清进行稀释，使稀释后的血清中每个指标在利用免疫斑点法检测，其结果为弱阳性而得到弱阳性血清；(1.2)对按步骤(1.1)中所得到弱阳性血清作进一步梯度稀释，得到2～5个浓度梯度血清；(1.3)对按步骤(1.2)中所得到的每个浓度梯度血清，进行芯片反应实验，每个浓度梯度血清重复10孔，对每个浓度梯度血清样本中各指标的信号值计算平均值标准差S样品；(1.4)取具有统计学意义数量的健康人阴性血清样本，进行芯片反应实验，计算阴性血清样本中各指标信号的百分位数Pr，取99分位数P值；(1.5)比较步骤(1.3)中不同浓度梯度血清各个指标的值与步骤(1.4)步中的Pr值，以最接近于Pr值的那个浓度梯度血清的浓度作为制备为各指标临界值参考品浓度；(1.6)按照步骤(1.5)步中确定的各指标临界值参考品浓度，选取阳性血清，用健康人阴性血清进行稀释制备临界值一级参考品；(2)选用阳性对照品作为待测样本，进行芯片反应实验，重复反应10孔，计算阳性对照品的各个指标信号值平均值(3)选用临界值一级参考品作为待测样本，进行芯片反应实验，重复反应2孔，计算临界值一级参考品的各个指标信号值平均值(4)利用下述公式求取指标临界值系数指标临界值系数＝阳性对照品中该指标信号值的平均值/临界值参考品该指标信号值的平均值2.权利要求1所述的利用临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法，其特征在于，所述步骤(1.1)和步骤(1.6)中的阳性血清为Jo-1、SSA、SSB、Sm、Scl-70、RNP自身抗体指标阳性的血清中的一个或多个。3.权利要求1所述的利用临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中，得到4个浓度梯度血清；所述步骤(1.5)中是比较步骤(1.3)中4个浓度梯度血清各个指标值与步骤(1.4)步中的Pr值。4.用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的实验结果判定方法，其特征在于：利用蛋白质微阵列芯片和化学发光技术对多种自身抗体并行检测时，实验结果判定为研究对象，利用“临界值一级参考品”确定阳性对照品中各自身抗体指标的“临界值系数”，再利用每次实验中阳性对照品的信号值与“临界值系数”确定各自身抗体指标的临界值信号，并对实验结果作出判定。5.如权利要求4所述的用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的实验结果判定方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)临界值一级参考品的制备步骤；(2)利用步骤(1)制备的临界值一级参考品，采用具有统计学数据处理方法，给阳性对照品中各自身抗体指标确定临界值系数步骤；(3)在每次实验中，利用阳性对照品中的各指标信号值与对应的各指标的临界值系数确定此次实验中各指标...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻长杰，柳飞舟，姚涌，
申请(专利权)人：上海铭源数康生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：