瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针技术

本发明专利技术公开了一种瓜上10种病害的微阵列芯片。本发明专利技术还同时公开了利用上述芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，对每个待测样品依次进行以下步骤：1)、提取待测样品的DNA；2)、引物荧光标记PCR反应；3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；4)、芯片杂交与洗涤：将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物或者将步骤3)所得的混合物95℃变性5min，然后冰浴5min，得预处理后PCR扩增产物；然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45℃杂交1h；5)、芯片扫描，获得检测结果。

【技术实现步骤摘要】
瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针
本专利技术涉及植物病害检测领域，特别是瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针。
技术介绍
随着分子生物学技术的发展，植物病害的检测技术由传统的形态学鉴定发展到现在的分子检测水平，从检测的速度、灵敏度准确性等各个方面都有很大的进步。血清学检测、普通PCR检测技术、荧光PCR检测技术的应用使得病害的检测在灵敏度、特异性、准确性上更进一步，但这类检测技术已不能完全满足大量、快速、灵敏对植物病害检测的要求，基因芯片技术的出现，将样品检测和分析过程实现连续化、集成化和微型化，且具有高通量、高灵敏度检测水平，能够同时对多种样品中多种病原进行检测。基因芯片技术是20世纪90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析。它是一种快速、高效、高通量分析生物信息的工具。基因芯片在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表达情况的分析、疾病诊断、病原菌检测、药物开发和筛选等诸多领域的研究中得到了广泛应用，受到人们的普遍重视。当前随着经济全球化和世界贸易量的持续增长，一些病原微生物也开始快速流行。瓜类是我国重要的经济作物。随着我国近年来对外贸易的快速发展，瓜类种子进口量逐步上升，有害生物随进境瓜类种子传入我国的可能性加大。在引种的过程中加强对病原物的检疫，防止疫病传播蔓延是我们的重要工作之一。因此建立快速、高效、灵敏、特异的检测方法对加强进出口瓜类种子检疫有十分重要的意义。甜瓜黑点根腐病菌(MonosporascuscannonballusP.)、瓜蔓枯病菌(MycosphaerellamelonisC.)、瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare)、黄瓜黑星病菌(Cladosporiumcucumerinum)、黄瓜黑色根腐病菌(Phomopsissclerotioides)这类真菌，瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliW.)、瓜细菌性角斑病菌(Psendomonassyringaepv.lachrymans)这类细菌以及南瓜花叶病毒(Sqashmosaicvirus)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus)这类病毒是危害瓜类的重要病原物。在新疆局瓜种子出口贸易中，这10种病害每年都有上百批的的检测需求，在面对大量检测样品时，尤其在同一样品要求检测多种病害的情况下，难以实现高通量快速同步多病害检测，尤其是真菌、细菌病害分离周期非常长，经验要求很高，阳性样品确定难度大，灵敏度不高，极大的影响了最终的检测结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针，本专利技术能实现检验检疫准确、快速、简便、高通量的技术要求。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片，该芯片包含如下寡核苷酸探针中的至少一类(涉及瓜炭疽病菌时，瓜炭疽病菌T-GAPDHx、瓜炭疽病菌T-GSx必须同时使用)；瓜蔓枯病菌Db-Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；瓜炭疽病菌T-GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；瓜炭疽病菌T-GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；瓜细菌性果斑病菌aac-Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；黄瓜花叶病毒CMV-Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；南瓜花叶病毒SqMV-Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。本专利技术还同时提供了利用上述芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，对每个待测样品依次进行以下步骤：1)、提取待测样品的DNA；配置成浓度为5-20ng/μl作为模板；2)、引物荧光标记PCR反应：反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl22.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板1.0μl；PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；上下游引物分别为以下(每种病菌对应一套引物，即具体为：瓜炭疽病菌对应2对引物，其余病菌对应1对引物)：瓜蔓枯病菌Db-3x：CGTAAGTAGACCTCCACCACDb-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；甜瓜黑点根腐病菌Mc-1x：CATTAAAGAGTTATCCAACTCCMc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；瓜炭疽病菌GAPDH-3x：CCCTTCATTGAGACCAAGTGAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；瓜炭疽病菌GS-3x：TTCGTTCTCGAACACGAT；GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；瓜细菌性果斑病菌aac-1x：CTGGGAGCGATCTTCATCaac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；黄瓜黑色根腐病菌Phs-1x：CAACCACTCCCTCCCTT；Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；黄瓜黑星病菌Cc-3x：ATCGAGAAGTTCGAGAAGG；Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；瓜细菌性角斑病菌Psl-1x：GGCGACGCAATCAATGAT；Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；黄瓜花叶病毒CMV-1x：TCCGAGGAATTAAATGTTGA；CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；南瓜花叶病毒SqMV-1x：ACTTTGAAGTGGCTGGAAA；SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-1x：CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG；Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；备注：上游引物标记Cy3；3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；备注说明：假设当为瓜炭疽病菌和另一种病菌时，共获得3种PCR扩增产物，将此3种PCR扩增产物按照1:1:1的体积比进行等体积混合；其余依次类推；4)、芯片杂交与洗涤：将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物(备注说明：当为瓜炭疽病菌时，由于其有对应2对引物，因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】
瓜上10种病害的微阵列芯片，其特征是：所述芯片包含如下寡核苷酸探针中的至少一类；瓜蔓枯病菌Db‑Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；甜瓜黑点根腐病菌Mc‑Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；瓜炭疽病菌T‑GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；瓜炭疽病菌T‑GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；瓜细菌性果斑病菌aac‑Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；黄瓜黑色根腐病菌Phs‑Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；黄瓜黑星病菌Cc‑Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；瓜细菌性角斑病菌Psl‑px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；黄瓜花叶病毒CMV‑Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；南瓜花叶病毒SqMV‑Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv‑Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。...

【技术特征摘要】
1.用于检测瓜上10种病害的微阵列芯片，其特征是：所述芯片包含如下10类寡核苷酸探针；瓜蔓枯病菌Db-Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；瓜炭疽病菌T-GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；瓜炭疽病菌T-GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；瓜细菌性果斑病菌aac-Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；黄瓜花叶病毒CMV-Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；南瓜花叶病毒SqMV-Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。2.利用权利要求1所述的芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，其特征是：对每个待测样品依次进行以下步骤：1)、提取待测样品的DNA；配置成浓度为5-20ng/μl作为模板；2)、引物荧光标记PCR反应：反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl22.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板1.0μl；PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；上下游引物分别为以下：瓜蔓枯病菌Db-3x：CGTAAGTAGACCTCCACCACDb-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；甜瓜黑点根腐病菌Mc-1x：CATTAAAGAGTTATCCAACTCCMc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；瓜炭疽病菌GAPDH-3x：CCCTTCATTGAGACCAAGTGAPDH-4x：GTACTTGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翀，高全，孙燕飞，雷勇辉，张小菊，李亚伟，张祥林，张伟，巴哈提古丽·马那提拜，
申请(专利权)人：新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65