本发明专利技术公开了一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包括：（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；（2）标准阳性血清；（3）标准阴性血清；（4）稀释液；并提供了其应用。本发明专利技术提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其有益效果包括以下方面：试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明专利技术中的试剂盒在检测样品时只需要使用几种简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用；结果判定直观，眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
【技术实现步骤摘要】
一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及检测试剂盒，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌iRiemerella anatipestifer, RA)是鸭疫里氏杆菌病的病原，可引起家鸭、鹅、火鸡及多种家禽和野禽发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性浆膜炎(duckinfectious serositis)。发病鸭比较明显的病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎等。类似的病理变化也见于火鸡和其它禽类。本病最早于1932年在美国纽约州的长岛发现，随后迅速蔓延至世界各地。我国在1982年首次证实本病存在，目前各养鸭省区均有发生，且发病率和死亡率很高，给养鸭业造成重大经济损失。RA血清型众多，目前报道确认的有21个血清型，各血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，给疫苗预防带来了很大难度。我们从山东、河南以及广东的鸭场中分离到87株RA，用玻板凝集试验和试管凝集试验对其血清型进行了鉴定。其中血清I型27株，血清2型25株，血清10型18株，其它血清型17株，说明目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型。用试剂盒检测RA抗体是诊断RA感染进而开展RA流行病学调查的有效手段。琼脂扩散试验可检测RA血清抗体，但敏感性较低。另外，间接ELISA方法研究的较多，使用的抗原种类有灭活全菌体、超声波破碎菌体后的裂解物、脂多糖、表达的重组蛋白等。绝大多数报道仅仅初步建立了 ELISA方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验，验证ELISA方法的实际应用效果。到目前为止，没有一种实现商品化的检测RA血清抗体的试剂盒，在国内外都是空白。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，鉴于目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型，提供了一种可简单快速的检测RA血清1、2和10型抗体的试剂盒，用来开展大范围的RA流行病学调查和免疫水平监测。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒,所述试剂盒中包括: (O鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原； (2)标准阳性血清； (3)标准阴性血清； (4)稀释液。进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述制备鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6。进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤: 1)静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4°C静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为PH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液； 2)将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原； 3)以步骤2)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤I)得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50 μ g/ml-100 μ g/ml ο进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，述标准阳性血清的制备方法为:取-75 °C冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于IOml含5%小牛血清的营养肉汤中，37°C,200r/min培养15-18小时，然后把IOml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37°C摇床中200r/min培养12-15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用IOml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用鸭疫里默氏杆菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫兔，得到分离血清，效价达25及以上即为标准阳性血清。进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阴性血清的制备方法为:收集体重2.5公斤的健康新西兰白兔的颈动脉血，室温过夜，再以离心转速3000r/min离心15min,取上清即得到标准阴性血清。进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述稀释液的制备方法为:配制PH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4.12H20，30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。本专利技术的第二个目的是提供了上述一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌血清I型、血清2型和血清10型抗体效价中的应用。进一步的，上述的应用，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为: a)在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1_12孔，第8排的1_8孔各加稀释液50μ I ； b)在血凝板1-6排的第I孔各加I份待检血清,每份血清50μ 1，用排枪从血凝板1-6排的第I孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第I孔加50 μ I标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第I孔加50 μ I标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照； c)每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μI ; d)血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37°C静置1.5-2小时； e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其优越性包括以下方面: a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本专利技术中的试剂盒在检测样品时只需要110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃盖板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用； b.结果判定直观，眼观即可； c.操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测； d.成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。【附图说明】图1为RA血清I型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。图2为RA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；（2）标准阳性血清；（3）标准阴性血清；（4）稀释液。
【技术特征摘要】
1.一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括: (1)鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原； (2)标准阳性血清； (3)标准阴性血清； (4)稀释液。2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述制备鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清I型WF2、血清2 型WF7和血清10型XY6。3.根据权利要求2所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。4.根据权利要求3所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤: 1)静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4°C静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为PH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液； 2)将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原； 3)以步骤2)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤I)得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50 μ g/ml-100 μ g/ml ο5.根据权利要求4所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为:取_75°C冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于IOml含5%小牛血清的营养肉汤中，370C，200r/min培养15-18小时，然后把IOml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37°C摇床中200r/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，郑福英，宫晓炜，陈启伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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