一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用，通过自制的PMMoV抗血清(第一抗体)作为主要试剂组装了PMMoV的ID-ELISA检测试剂盒，可应用于辣椒中PMMoV的检测。该试剂盒具体包含阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物PNPP、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液、5块96孔酶标板和使用说明书1份。以待检测抗原如病毒粒体免疫家兔等脊椎动物可在动物体内诱导产生特异性的抗血清(多克隆抗体)，抗血清可特异性识别并与抗原结合，因此可用于检测样品是否含抗原，填补了国内在PMMoV抗血清制备及相应ELISA检测应用方面的空白。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用，通过自制的PMMoV抗血清(第一抗体)作为主要试剂组装了PMMoV的ID-ELISA检测试剂盒，可应用于辣椒中PMMoV的检测。该试剂盒具体包含阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物PNPP、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液、5块96孔酶标板和使用说明书1份。以待检测抗原如病毒粒体免疫家兔等脊椎动物可在动物体内诱导产生特异性的抗血清(多克隆抗体)，抗血清可特异性识别并与抗原结合，因此可用于检测样品是否含抗原，填补了国内在PMMoV抗血清制备及相应ELISA检测应用方面的空白。【专利说明】
本专利技术属于酶学、免疫学或生物学
，尤其涉及一种PMMoV贵州分离物 ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。 -种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法 与应用
技术介绍
植物病毒病又被称为"植物癌症"，目前没有有效的治疗方法。对植物病毒病快速、 准确的检测有助于病株的早期发现、隔离和销毁，也是植物抗病育种和脱毒苗的培育所必 须的。诊断植物病毒的方法有传统生物学方法、电镜观察法、血清学方法和分子生物学方法 等。 血清学方法是检测植物病毒最为常用和有效的手段之一。目前应用最广泛的血清 学检测方法是酶联免疫吸附法（ELISA)和斑点免疫结合测定法（DIBA)，DIBA法操作程序比 ELISA法要简单，但其检测灵敏度低于ELISA法。 ELISA检测方法的基本原理是：以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。利 用酶标抗体、抗原或次抗原作为一个检测体系，其灵敏度较高，可检测到纳克（ng)水平 的病毒，并且可以减少检测时间，进行大规模样品调查，使常规病毒诊断变得非常容易， 特别适合脱毒苗的检测。目前，应用最多的是双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)和间接 ELISA (ID-ELISA)等方法。 DAS-ELISA检测法将已知抗体吸附于固相载体，加入待检样品（含相应抗原）与之 结合，温育后洗涤，加入酶标抗体和底物，使抗体/抗原/酶标记抗体复合物与底物反应，呈 现深浅不同的颜色反应。这种方法的优点：专业性强，灵敏度高、应用广泛，在国外已形成商 业化生产。但是DAS-ELISA存在一定的缺点：（1)检测每种病毒都需要制备相应的酶标记 特异性抗体，标记过程比较复杂，对技术和成本要求均高；（2)生产单克隆抗体存在杂交瘤 细胞系的退化和某些杂交瘤细胞系在大鼠腹腔中不能诱生腹水的问题。 ID-ELISA检测法将待检样品（含相应抗原）吸附于固相载体，加入第一抗体（抗 血清）与之结合，温育后洗涤，加入能识别第一抗体的酶标第二抗体和底物，使抗原/ 一抗 /酶标二抗复合物与底物反应，呈现深浅不同的颜色反应。ID-ELISA的缺点：对病毒检测的 特异性和灵敏度比DAS-ELISA的要低；优点：（1)无需针对每种待检病毒都制备相应的酶标 记特异性抗体，降低成本和时间；（2)抗血清的制备方法容易，来源广泛。 目前，国内未见有辣椒轻斑驳病毒（PMMoV)特异性抗血清制备、ELISA检测方法的 建立和相应试剂盒制备的相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒。 本专利技术的再一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒的制备 方法，尤其是其中PMMoV特异性抗血清的制备方法。 本专利技术的另一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在检测 辣椒PMMoV的检测方面的应用，旨在解决辣椒轻斑驳病毒（PMMoV)的血清学检测尚属空白 的问题。 本专利技术是这样实现的，一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒，包括：阳性对 照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓 冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液以及96孔酶标板；其中，PMMoV特异性抗血清的制备包 括以下具体步骤： (1)根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT-PCR引物： 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG， 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA ; (2)对感染PMMoV贵州辣椒分离物的组织进行RT-PCR扩增、纯化以及回收，得到 CP基因片段； (3)将所述CP基因片段和原核表达载体pET32a(+)以Nco I和EcoR I两种DNA 限制性内切酶进行双酶切处理、片段回收、连接、重组质粒转化大肠杆菌、重组CP蛋白表达 以及重组CP蛋白回收； (4)将所述重组CP蛋白作为抗原免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清，免疫后取兔 血，即得到PMMoV特异性抗血清。 优选地，所述阳性对照为含PMMoV病毒的辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所 述阴性对照为健康无毒辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述酶标二抗为碱性磷酸酶标 记的羊抗兔抗体溶液。 本专利技术进一步提供了上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在辣椒PMMoV 的检测方面的应用。 酶联免疫吸附测定法（ELISA)是检测生物样品中是否含有特定蛋白质（或特定病 毒）的一种常规方法，其准确性和灵敏度都较高。间接ELISA法的基本原理为：将待检样 品中所有蛋白固定（吸附、或包被）在一支持表面上，加入能识别并与待检抗原结合的抗 体（抗血清），样品中若有抗原则抗体（第一抗体）与其结合，再加入能识别第一抗体的酶 标记第二抗体（酶标二抗），最后加入过量的该酶的底物（反应物），则底物在酶的催化下 不断转变为有颜色的产物，最终将抗原存在的信号放大。本专利技术利用自制的PMMoV抗血清 (第一抗体）作为主要试剂组装了 PMMoV的ID-ELISA检测试剂盒，可应用于辣椒中PMMoV 的检测。该试剂盒具体包含阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物 PNPP、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液、5块96孔酶标 板和使用说明书1份。以待检测抗原如病毒粒体免疫家兔等脊椎动物可在动物体内诱导产 生特异性的抗血清（多克隆抗体），抗血清可特异性识别并与抗原结合，因此可用于检测样 品是否含抗原。 与现有技术的不足相比，本专利技术所具有的有益效果为： (1)本专利技术采用pET32a(+)和BL21 (DE3)原核表达系统，使得所制备的抗原（重组 PMMoV外壳蛋白）是高度可溶的，便于采用亲和层析纯化抗原，同时也保证了抗原的质量。 与通过提纯完整的病毒粒体作为抗原来制备抗血清的方法比较，采用原核表达制备抗原具 有成本低和步骤简单的优点。 (2)本专利技术PMMoV特异性抗血清具有高特异性，针对待测病汁液的效价达1:8000。 (3)本专利技术的试剂盒可对辣椒样品中的PMMoV检测灵敏度达0. 3 lmg/mL PMMoV病 汁液（即病叶提取液在稀释3200倍后仍可被检测到）；同一样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PMMoV贵州分离物ID‑ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液以及96孔酶标板；其中，PMMoV特异性抗血清的制备包括以下具体步骤：(1)根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT‑PCR引物：正向引物：5'‑CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，反向引物：5'‑GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA；(2)以感染PMMoV贵州辣椒分离物的组织总RNA作为模板，进行RT‑PCR扩增、纯化以及回收，，得到CP基因片段；(3)将所述CP基因片段和原核表达载体pET32a(+)以Nco I和EcoR I两种DNA限制性内切酶进行双酶切处理、片段回收、连接、重组质粒转化大肠杆菌、重组CP蛋白表达以及重组CP蛋白回收；(4)将所述重组CP蛋白作为抗原免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清，免疫后取兔血，即得到PMMoV特异性抗血清。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：乙引，洪鲲，万晴姣，张宇斌，
申请(专利权)人：贵州师范大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52