抑制c-MET二聚化的新型抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及抑制c-MET二聚化的新型抗体及其用途，进一步地，本发明专利技术涉及选择能够抑制c-Met的配体依赖性和配体非依赖性激活的抗c-Met抗体的方法。更具体地，所述的方法基于对c-Met二聚化的抑制。另一方面，本发明专利技术涉及用于制备治疗恶性肿瘤的药物的这种抗体和包含这种抗体的组合物。诊断方法和试剂盒也是本发明专利技术的一部分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及能够特异性结合人C-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的新型抗体，特别是鼠的，嵌合的和人源化来源的单克隆抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核苷酸序列。更具体而言，本专利技术所述的抗体能够抑制C-Met 二聚化。本专利技术也包含这些抗体作为药物在预防性和/或治疗性处理恶性肿瘤或与所述受体过表达有关的任何病变中的用途，以及在诊断与C-Met过表达有关的疾病的过程中和试剂盒中的用途。本专利技术最后包含含有所述抗体联合针对在肿瘤进展或转移中涉及的其他生长因子的其他抗体和/或化学化合物，和/或化合物和/或抗恶性肿瘤制剂或与毒素结合的制剂的产品和/或组合物，以及它们在预防和/或治疗某些恶性肿瘤中的用途。
技术介绍
已经显示，受体酪氨酸激酶(RTK)靶向剂如曲妥单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂有利于以该蛋白质类为靶标用于治疗选定的恶性肿瘤。c-Met是RTK亚家族的原型成员，该亚家族也包括RON和SEA。c_Met RTK家族与其他RTK家族在结构上有区别并且是肝细胞生长因子(HGF，也称离散因子，SF)的唯一已知的高亲和性受体。c_Met和HGF在多种组织中广泛表达，它们的表达一般分别限定于上皮和间充质来源的 细胞。两者对于正常的哺乳动物的发育都是必需的，并且已经表明它们在细胞迁移、形态分化和三维管状结构的组织以及生长和血管发生中特别重要。已经表明，c-Met和HGF受控制的调节在哺乳动物发育、组织保持和修复中是重要的，它们的失调涉及到恶性肿瘤的进展。c-Met的不适当的激活导致的异常信号传导是在人的恶性肿瘤中观察到的最常见的改变之一，在肿瘤发生和转移中起关键作用。不适当的c-Met激活可通过配体依赖性和非依赖性机制(包括c-Met过表达，和/或旁分泌或自分泌激活)发生，或通过获得性功能突变发生。然而，在配体存在或不存在情况下的c-Met受体的寡聚化在调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和力和结合动力学中是必需的。激活的c-Met募集信号传导效应物到它位于胞质区中的多停泊位点(multidockingsite)，导致几个关键的信号传导途径的激活，这些信号传导途径包括Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Stat3。这些途径对于肿瘤细胞的增殖、浸润和血管生成和对于逃避细胞凋亡是必需的。此外，相对于其他 RTK，c_Met 信号传导的独特之处在于已经报道的它与粘着斑复 合物和非激酶结合伙伴如α6β4整合素，CD44v6，Plexin BI 或信号素(semaphorin)之间的相互作用，这可进一步增加了这一受体调节细胞功能的复杂性。最后，近期的数据证明，c-Met可能涉及肿瘤对吉非替尼和埃罗替尼的抵抗，这提示联合靶向EGFR和c-Met 两者的化合物可能有重要意义。在过去几年中，已开发出许多不同策略用来减弱恶性肿瘤细胞系中的c-Met信号传导。这些策略包括i)抗c-Met或HGF/SF的中和抗体或使用 HGF/SF 的拮抗剂 NK4 来阻止配体结合 c-Met ；ii) c-Met 的小 ATP 结合位点抑制剂来阻断激酶活性 ；iii)影响通向多停泊位点的工程化的 SH2区多肽，和降低受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大部分表现出c-Met的选择性抑制，从而导致肿瘤的抑制，并且表明c-Met在恶性肿瘤的治疗性干预中可能是令人感兴趣的。所产生的靶向c-Met的分子中，有些是抗体。最广泛描述的是Genentech生产的抗c_Met5D5抗体，其在多种模型中单独加入时作为强力激动剂起作用，当用作Fab片段时作为拮抗剂起作用。这一抗体的单价的工程化的形式被描述为单臂(0AOT5)，在大肠杆菌中作为重组蛋白质而产生，这也是Genentech专利申请的主题。然而，这一分子由于它特定的支架(scarfold)而不能被认为是抗体,它也表现出能产生对于人具有免疫原性的突变。在活性方面，这一未糖基化的分子不具有效应物的功能，并且最后没有清楚的数据证明，0A5D5抑制c-Met的二聚化。此外，当在G55体内模型(表达c-Met但不表达HGF mRNA和蛋白质的成胶质细胞瘤细胞系，其不依赖于配体而生长)中试验时，单臂抗c-Met对G55肿瘤生长无显著效应，这提示0A5D5主要通过阻断HGF结合起作用，并且不能够靶向不依赖于HGF而激活的肿瘤。Pfizer描述的另一个祀向c_Met的抗体是通过“主要作为c_Met拮抗剂,并且在有些情况下作为c-Met激动剂”起作用的抗体。该申请没有描述显示Pfizer抗体对c-Met 二聚化的任何效应的数据。本专利技术的一个新的方面是产生没有内在的激动活性并且抑制C-Met 二聚化的鼠单克隆抗体。除了靶向配体依赖性肿瘤外，该方法也破坏由于c-Met过表达或细胞内区突变的配体非依赖性c-Met激 活，这种激活依旧依赖于寡聚化以进行细胞信号传导。这种抗体活性的另一方面可能是对c-Met和其伙伴之间的相互作用的产生空间位阻从而破坏c-Met的功能。除了与特异性阻断c-Met受体有关的功能之外，优选地这些抗体是人源化的和工程化的作为人IgGl以获得效应物功能如ADCC和⑶C，但不限于此。
技术实现思路
令人惊讶地，专利技术人第一次设法产生了能够结合c-Met也能够抑制c-Met 二聚化的抗体。在现有技术中，有时候提示能够抑制c-Met与其伙伴二聚化的抗体可能是令人感兴趣的抗体，如果这是真的话，也从来没有公开过，或清楚的提示有抗体能够做到这一点。此外，关于抗体的特异性，成功产生这种活性抗体根本是不明显的。第一方面，本专利技术的主题是产生和选择本专利技术所述的抗体的方法。更具体地，本专利技术涉及选择能够抑制配体依赖性和配体非依赖性C-Met激活的抗c-Met抗体或其功能片段之一或衍生物的方法，所述的方法包含下述步骤:i)筛选所产生的抗体,选择能够特异性结合c-Met的抗体；ii)体外评价步骤i)中选定的抗体，并且选择能够至少50%,优选至少60%, 70%或80%地抑制至少一种肿瘤类型的肿瘤细胞增殖的抗体；iii)试验步骤ii)中选定的抗体,选择能够抑制c_Met 二聚化的抗体。如前面所解释的，由于这种抗体对于更大人群的病人具有实际的意义，抑制C-Met二聚化是本专利技术的首要方面。不仅配体依赖性激活的c-Met恶性肿瘤(正如直到本专利技术的情况)，而且配体非依赖性激活的c-Met恶性肿瘤也能通过本专利技术所述的方法产生的抗体进行治疗。抗体的产生可通过本领域技术人员已知的任何方法来实现，例如，将骨髓瘤细胞与从免疫小鼠或任何其他与选定的骨髓瘤细胞相容的物种获得的脾细胞融合。免疫动物可包括带有人免疫球蛋白质位点的转基因鼠，其然后能直接产生人抗体。其他可能的具体实施方式可能在于使用噬菌体显示技术以筛选文库。筛选步骤i)可通过本领域技术人员已知的任何方法或过程来实现。作为非限制性例子，可以提及的是ELISA、BIAcore、免疫组化、FACS分析和功能性筛选。优选的方法在于通过ELISA对c-Met重组蛋白质进行筛选，并且然后通过FACS分析至少一种肿瘤细胞系，以确定所产生的抗体也能够识别肿瘤细胞上天然的受体。这一方法将在下述的实施例中进行更精确的描述。同样，步骤ii)也可通过已知的方法或过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的抗体或其功能性二价片段或衍生物之一，其特征在于所述抗体包含重链和轻链，所述的重链包含CDR?H1、CDR?H2和CDR?H3，它们分别包含氨基酸序列SEQ?ID?No.56、57和58；所述的轻链包含CDR?L1、CDR?L2和CDR?L3，它们分别包含氨基酸序列SEQ?ID?No.59、60和61。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：L·格奇，
申请(专利权)人：皮埃尔法布雷医药公司，
类型：发明
国别省市：