乙肝病毒Ｃ抗体的体外检测方法技术

一种乙肝病毒Ｃ抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的乙肝病毒Ｃ抗原，与待测抗体和结合有标记物的抗体同时结合，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。检测结果与人的认识习惯相一致，更便于操作和判断。本方法还提高了检测的灵敏度和重复性，增强了检测特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乙肝病毒抗体的检测方法，尤其涉及一种乙肝病毒C抗体的体外 检测方法。用该方法检测乙肝病毒C抗体能使检测更准确，且结果更直观。
技术介绍
乙型(病毒性)肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus,HBV)引起的一种世 界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者超过2. 8亿。我国 约占9300万，大多数人无症状，但其中的1/3会出现肝损害的临床表现。目前通过三种途径对乙型肝炎进行诊断，如检测病毒的抗原、检测体内抗体以及 检测病毒的DNA。临床上，通常使用五种标识物进行判断，如乙肝表面抗原(h印atitis B surface antigen,HBsAg) > Zi 13^ Jfi{φ (antibodies to hepatitis B surface antigen, HBsAb)、乙月干 e 抗原(hepatitis B core antigen, HBeAg)、乙月干 e 抗体(antibodies to the' e' antigen,anti-Hbe/HBeAb)禾口乙月干核心抗体(antibodies to the core antigen, anti-Hbc/HBcAb)，又称“两对半”。乙肝病毒DNA则用来诊断和观察慢性乙型肝炎。当血液 中病毒DNA数量稳定或增加较少时，说明病情较为稳定；当病毒DNA数量不断增多，则说明 病情正在恶化。HBsAg出现于乙肝患者血清中谷丙转氨酶升高之前，直至恢复期时，HBsAg的滴度 才会逐步降低乃至消失，但有部分患者HBsAg可持续存在。在绝大多数乙肝病毒感染者的 外周血中，含有5ng-600y g/ml的HBsAg。血清中的HBsAg仅仅是个体受到HBV感染的标 志，并不反映病毒复制与否、病毒复制程度以及病毒的传染性强弱等。急性乙肝病人恢复期 后，随着HBsiVg逐步降低乃至消失，血清中会出现对HBV感染具有保护性免疫作用的HBsAb。 一般情况下，血清中的HBsAb和HBsAg不会被同时检出。HBV的前核心(pre-core) /核心(core)基因直接编码两种多肽，其为组成病毒核 壳体的21kD亚基p21c和经分泌过程产生的17kD亚基肽pl7e (切去定位于内质网的四个 氨基酸的pre-core信号肽)。p21c即为血清学上定义的HBcAg，pl7e即为血清学上定义的 HBeAgo也有文献报道在血清分离出带有-10—1前核区段的HBeAg(Virology 1988，163， 268-275)和含有全部四个氨基酸的 HBeAg(J. Immunol.，1991，147，3156-3160)。HBeAg 和 HBcAg约有75%的同源性，其在血清中的出现时间稍晚于HBsAg。一般情况下，若HBeAg检 测为阳性时，HBsAg检测亦为阳性，HBeAg阳性结果还表明病毒的传染性强。若这种情况持 续3个月以上，则有慢性化倾向。当血清中的HBeAg标识物检测结果为阴性后，体内会出现 HBeAb。血清检测HBeAb阳性结果表明病毒复制减少，传染性减弱。因此，对乙肝病人血清 中HBeiVg和HBeAb标识物的准确测定对乙型肝炎的诊断、预防和治疗具有重要的指导作用。HBcAb是判断乙肝病情的重要指标。随着急性乙肝的恢复，HBcAb滴度会降低乃 至消失。若该标识物在血清中持续高滴度，则表明乙肝病情有向慢性化发展的倾向。在慢 性乙肝患者中，HBcAb的检出率及滴度较高说明乙肝病毒复制活跃，还表明了病毒的传染性 强。3在乙肝的临床诊断和治疗过程中，通常采用将HBsAg、HBsAb, HBeAg, HBeAb和 HBcAb等五种标识物中的几种相结合的方式来判断乙肝病情。若病人血清中HBsAg、HBeAg 和HBcAb三种标识物检测均为阳性时，就可以确定该患者正受到乙肝病毒感染，且病毒正 在活跃复制，病毒数量较多，传染性也较强。若病人血清中HBsAg、HBeAb和HBcAb三种标识 物检测均阳性时，表明乙肝病情好转，病毒复制数量减少。酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前用于HBsAg、 HBsAb, HBeAg, HBeAb和HBcAb五种标识物体外检测的常用方法。其中，HBsAg、HBsAb和 HBeAg采用ELISA双抗体(双抗原)夹心法，如中国专利技术专利申请200610030783. 3公开 的对乙肝病毒核心抗原的体外检测，HBeAb和HBcAb均采用ELISA竞争法，即在抗体结合抗 原的过程中，待测样品中的抗体与标记抗体相竞争。使用“夹心法”检测时，溶液显色则表 明该标识物检测结果呈阳性(+)，溶液无色表明检测结果呈阴性(_)。这种判断方式与人们 的习惯相一致。而在“竞争法”中，其是待测样品中的抗体与标记抗体对结合抗原的竞争， 当标记抗体的浓度大于待测样品中的抗体时，溶液色深，表明标识物呈阴性(_)；当待测样 品中的抗体的浓度大于标记抗体时，溶液无色或色浅，表明检测结果为阳性(+)。在应用于 ELISA检测的酶标记结合物由于温度、湿度或化学氧化等原因而使蛋白酶发生变性、失活或 降解时，就无法实现酶促反应使底物生色，这对于采用ELISA竞争法检测的HBeAb和HBcAb 而言，其将直接导致假阳性(+)的检测结果。这妨碍了医生对患者采用正确的方法或药物 进行治疗，使医疗资源无法高效配置。此外，对受试者的心理状态也会产生较大影响，还会 对其日常生活产生种种影响。另外，ELISA竞争法在检测HBeAb和HBcAb标识物中检测灵 敏度较低，因此，不能准确检测待测标本中HBeAb和HBcAb标识物的含量。一方面，ELISA竞争法在检测HBeAb和HBcAb标识物中存在诸多问题与缺陷。另一 方面，也由于HBeAg和HBcAg这两种抗原的分子量比较小(小于20kDa)，当应用于ELISA时 很难通过物理吸附的方式有效包被于酶标板表面，而对相应抗体的准确检测产生影响。目 前这些问题主要可以通过两种方法进行解决，如雅培(Abbott)公司推出了一款将化学发 光技术应用于免疫检测的系列产品——ARCHITECT。检测过程中，先将稀释的样品和HBc/ HBe抗原包被的顺磁颗粒混合，使样品中的抗HBc/抗HBe与包被于微球的HBc/HBe抗原结 合。清洗后，加入对水解更为稳定的吖啶(acridinium) (US5，468，646)标记的抗人IgG抗 体结合物。之后，再次清洗，向反应容器中加入预触发O^re-Trigger)和触发(Trigger)溶 液。最后检测化学发光反应产生的相对光单位(relative light imitS，RLUS)。该检测的 专一性可以达到99. 37%-99. 73%。中国专利技术专利申请200510033411. 1和200610107394. 6 也公开了几种化学发光法定量检测乙肝病毒抗体的方法，比较后发现，其各自的原理是相 一致的。由于这类方法需要重新配置专用仪器，不仅将对现有仪器造成空置，该仪器也不能 适用于其它检测。因此，其可替代性、通用性和普及性等诸多方面都存在一些缺陷。CORNING公司目前提供一种检测表面处理技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙肝病毒Ｃ抗体的体外检测方法，使用具有两个以上抗体识别表位的抗原，与待测抗体和结合有标记物的抗体同时结合，直接检测标记物或加入反应底物后检测能确定待测抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱绍荣，
申请(专利权)人：上海荣盛生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]