本发明专利技术属化学合成药物领域，涉及化合物苯丙氨酸衍生物（ＷＥＮ）在抗乙肝病毒复制中的药用用途。本发明专利技术利用乙肝病毒基因组转染细胞研究病毒复制技术，分别用不同浓度的苯丙氨酸衍生物进行抑制ＨＢＶ复制实验，结果显示，不同浓度ＷＥＮ并不影响ＨＢＶ表达的病毒蛋白，但６０μＭ ＷＥＮ明显抑制已转染有ＨＢＶ复制细胞的作用，证明所述的苯丙氨酸衍生物具有抗乙肝病毒复制的新用途，本发明专利技术的苯丙氨酸衍生物可制成药物，治疗乙肝病毒引起的或相关的疾病；或在修饰其结构获得衍生物，用于提高疗效及降低对细胞的毒性，以及用所述ＷＥＮ单独或与其他药物或制品联合应用于实验及临床研究。
Use of phenylalanine derivative in preparing anti hepatitis B virus medicine
The invention belongs to the field of chemical synthetic medicine, and relates to the medicinal use of a compound phenylalanine derivative (WEN) in the replication of hepatitis B virus. The invention uses the hepatitis B virus genome replication technique of transfected cells, respectively with different concentrations of phenylalanine derivatives to inhibit the replication of HBV experimental results showed that different concentrations of WEN did not affect the viral protein expression of HBV, but 60 M WEN inhibited HBV replication has been transfected cells, phenylalanine derivatives and proves that the new the use of anti hepatitis B virus replication, phenylalanine derivatives of the invention can be made into drugs, caused by the treatment of hepatitis B virus or related diseases; or to obtain derivatives in modification of its structure, to improve the efficacy and reduce toxicity to the cells, and using the WEN alone or with other drugs or products should be combined for experimental and clinical study.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属化学合成药物领域，涉及化合物苯丙氨酸衍生物(WEN)在抗乙肝 病毒复制中的药用用途，具体涉及所述的化合物在细胞内抗乙肝病毒复制的用途。 背景材料乙型肝炎病毒(HBV)是引起人类慢性乙型肝炎，肝硬化甚至肝癌的重要病因。 乙肝病毒的复制与上述疾病的发生与发展有重要相关性。病毒基因组所编码的病毒 DNA聚合酶是决定病毒复制性高低的关键组分。研究表明，乙肝病毒DNA聚合酶 由末端蛋白，连接臂，逆转录酶(RT)和RNaseH酶四部分组成。其中逆转录酶的作 用是以病毒前基因组RNA为模板，逆转录成病毒DNA，然后经过DNA复制子代 DNA [Radziwill, G. et al. 19卯.J Virol. 64:613-20.]。有研究公开了根据HBV的RT结构与功能，设计了数种抗乙肝病毒的药物，如 拉米呋啶(3TC)，恩替卡韦等。目前，己知的抗病毒RT药物，其中， 一大类为核 苷(酸)类似物，其抗病毒原理是通过掺入病毒DNA阻止核苷酸链继续延长而阻断病 毒复制；另一类为非核苷类药物，其大部分为不同的疏水性化合物，其抗病毒原理 是通过作用于RT中的疏水性口袋(pockets)而阻碍RT的正常功能[Karayiannis. 2003. J Antimicrob Chemother. 51:761-785.; Spence R. A. et al. 1995. Science. 267: 988-993.]。目前，临床上使用的HBVRT抑制剂均为核苷(酸)类似物。但是，长期 使用核苷(酸)类似物，可致使HBV对该类药物产生耐药性，为此，临床治疗需要研 发新的抗病毒药物。苯丙氨酸衍生物(WEN)曾被报道对丙型肝炎病毒聚合酶具有抑制作用[Wang M. et al. 2003, J. Biol. Chem. 278: 9489-9495.]。该化合物在2005年获得美国专利[US Patent: US 6,887,877 B2.];专利名称为治疗或预防黄病毒感染的化合物和方法 (Compounds and methods for the treatment or prevention of Flavivirus infections)。该专利公开了 WEN及其衍生物的结构，以及在治疗黄病毒科病毒感染中的应用。目前尚未见WEN及其衍生物用于抑制HBV尤其是HBV RT及其复制的报道。复旦大学分子病毒学实验室长期以来进行HBVRT的研究，在HBVRT拇指亚 区发现有一段氨基酸保守的序列，并证明该区突变后有影响HBV复制的作用[Lin， X. et al. 2001. J Virol. 75: 11827-33.; Wang YX. et al， 2007. J Med Virol. 79: 676-682.; WangYX. et al, 2007. FEBS Lett 581: 558-564.]，[中国专利申请号-200510112431.8]。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供苯丙氨酸衍生物的新的药用用途，具体涉及苯丙氨酸衍生 物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。本专利技术所述的苯丙氨酸衍生物((25)-2-[(2，4-二氯-苯甲酰基)-(3-三氟甲基苯基)-氨基〗-3-苯基-丙酸),((2s)-2-[(2,4-dichloro-benzoyl)-(3-trifluoromethylbenzyl)-amino] -3-phenyl-propionic acid， WEN)为现有技术公开的化学合成法合成的化合物。HBV尚无简单可行的体外细胞培养技术，本专利技术首先建立可代表HBV复制的 细胞内病毒复制的技术平台，以此为基础应用WEN与HBV作用检验WEN是否有 抗HBV的作用。本专利技术利用乙肝病毒基因组转染细胞研究病毒复制技术，测定苯丙氨酸衍生物 (WEN)抗乙肝病毒复制的作用。本专利技术进行了大量筛选抑制HBVRT化合物的研究，分别用不同浓度的所述的 WEN进行抑制HBV复制的实验，实验结果证明，所述的苯丙氨酸衍生物WEN具 有抗乙肝病毒复制的新用途，尤其是WEN在细胞内抗乙肝病毒复制。本专利技术所述的乙肝病毒可以是不同乙肝病毒基因型及耐药毒株。鉴于WEN可能作用于HBV RT拇指亚区，本专利技术在此基础进行了 WEN在抗 HBV复制中的应用实验采用已知的全基因组HBV转染Huh-7细胞及复制效率测定方法，进行WEN对 细胞内HBV复制抑制的测定，1、通过已知的磷酸钙共沉淀法将乙肝病毒基因组转染入Huh-7细胞(购自武汉 大学中国典型培养物保藏中心)，次日换液后，在培养上清中同时加入不同浓度的 WEN,并连续培养4-5天，提取细胞内的HBV核心颗粒中的病毒，提取方法按现 有技术(DNA Wang YX. et al, 2007. J Med Virol. 79: 676-682);2、 用Southern印迹法，与标记的HBV探针作分子杂交及放射自显影术，检验 在不同浓度的WEN存在条件下对细胞内HBV复制的影响；3、 通过分析杂交信号的强弱作细胞内HBVDNA含量测定，对比研究WEN处 理组和未处理组HBV复制特性的变化，验证WEN抗乙肝病毒的用途。结果显示，不同浓度(0.06、 0.6、 6禾B60pM) WEN并不影响HBV表达的病 毒蛋白；但60nMWEN明显抑制已转染有HBV复制细胞的作用，实验证实，所述 的苯丙氨酸衍生物WEN具有抗乙肝病毒复制的用途，尤其是WEN在细胞内抗乙 肝病毒复制。本专利技术所述的苯丙氨酸衍生物(WEN)可制成药物，治疗乙肝病毒引起的或相 关的疾病；或在所述WEN的基础上修饰其结构获得衍生物，用于提高疗效及降低对细胞 的毒性，以及用所述WEN单独或与其他药物或制品联合应用于实验及临床研究。本专利技术所述的乙肝病毒引起的或相关的疾病包括急性或慢性乙型肝炎、重症肝 炎、肝硬化、肝癌，或肝移植后的抗病毒治疗。附图说明图1是WEN对Huh-7细胞内HBV复制的作用结果，其中，A为WEN对HBV基因组转染细胞后细胞表达的病毒E和S抗原量的 影响；B为Southern印迹法检测WEN对HBV在细胞内复制的抑制作用。 具体实施例方式实施例1细胞水平测定不同剂量WEN对乙肝病毒复制的抑制作用 转染前一天将Huh-7细胞以每皿lxl(^个细胞接种于60 mm细胞培养皿中， 16-18小时后换5 ml新鲜DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素G， 100吗/ml链霉素，0.2 mM L-谷氨酰胺)，2~4小时后用20吗DNA (10吗含1.3 拷贝HBV基因组质粒DNA， 4吗pSEAP2-Contro1和6 |ig pCDNA3.1)按磷酸韦丐 共沉淀法分别转染Huh-7细胞。次日换新鲜培养液，并在培养液中加入0.06、 0.6、6和60^M不同剂量的WEN，连续培养4天后，取200 pl培养上清测定外源性表达 的SEAP (secreted alkaline phosphatase)含量以校正转染效率，然后抽提细胞内病 毒颗粒DNA，提取方法按现有技术(DNA Wang YX. et al, 2007. J Med Virol. 79: 676-682)，最后采用HBV特异性Southe本文档来自技高网...
【技术保护点】
苯丙氨酸衍生物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
【技术特征摘要】
1、苯丙氨酸衍生物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。2、 按权利要求1所述的用途，其特征是所述的苯丙氨酸衍生物还包括修饰其结 构后获得的衍生物。3、 按权利要求1所述的用途，其特征是所述的乙肝病毒为不同乙肝病毒基因型 或耐药毒株。4、 按权利要求1所述的用途，其特征是所述的用途是制备治疗乙肝病毒引起或...
【专利技术属性】
技术研发人员：王勇翔，胡有洪，闻玉梅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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