柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法技术

本发明专利技术公开了一种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，并给出了四组不同的特异性引物组，该方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需电泳及特殊仪器，便于在实验室和田间快速检测，该方法为柑橘碎叶病监测构建一个快速检测的技术平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种环介导等温扩增(ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermal Amplification, RT-LAMP)分子检测方法，特别涉及ー种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法。
技术介绍
柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威 胁柑桔生产的重要病原之一。CTLV在我国浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区曾造成比较严重的危害。应用和推广无病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前,柑桔无病毒苗木三级繁育体系已在我国多个柑桔产区建立，无病毒苗木得到了大面积的推广。为保证种苗安全，必须对采穗母本树进行定期鉴定，并对感染病毒的良种进行脱毒处理。这必然要求快速、灵敏的病毒检测技术。CTLV是发状病毒属(Capillovirus)正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为600 700nmX 15nm,基因组全长约6496nt, 5’端具帽子结构，3’端具Poly(A)尾巴。目前应用腊斯克枳橙等指示植物鉴定是CTLV检测的常规手段之一，但其检测周期较长(1-2年)并易受环境条件影响。血清学检测技术大大提高了 CTLV的检测速度，在美国、日本等国得到广泛应用。Kawai等还制备了 CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备不易，检测灵敏度有待提高。而RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。但是，它需电泳及特殊仪器，不便于在田间大规模应用。LAMP是由Notomi于2000年开发的ー种新型的核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩増。它避免了常规PCR温度循环的特殊要求，并且因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点，又在另ー层面上提高了它的应用价值。目前还没有研究建立特异、灵敏以及操作简单的柑橘碎叶病毒RT-LAMP检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种灵敏度高、特异性强、不需要电泳及特殊仪器的柑橘碎叶病毒RT-LAMP检测方法，用于柑橘碎叶病毒的田间早期诊断。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为ー种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，其特征在于所述特异性引物组为以下四组中的任意ー组第一组omp-FIP5! -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA-3!omp-BIP5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第二组omp-FIP 5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3'omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第三组omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'；第四组omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAACACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F3 5' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'omp-B3 5' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。本专利技术利用每组特异性引物中的4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，进行靶序列高效扩增，建立了简便、快速、成本低、灵敏度高和特异性强的CTLV环介导等温扩增(LAMP)检测方法，便于在田间大規模快速应用。本专利技术的柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法具体按照如下步骤完成(I)柑橘碎叶病病叶总RNA提取，采用Trizol法、微量抽提；(2)柑橘碎叶病的RT-LAMP扩增，配置反应体系为25 U L,所述反应体系中各组分的含量为 5 X Reaction Buffer 、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反转录酶2U, IuM omp-FIP、I u M omp_BIP、0. 5 u M omp_F3、0. 5 u Momp_B3、模板 RNA I. 0 u L,加 ddH20补足，混匀，于63°C水浴锅中反应60-80min，之后80°C下灭活IOmin结束反应；(3)反应结束后，观察浊度，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；或在反应液中加入显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性；0. 5 L反应液进行琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，图谱中出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性。在上述技术方案中，所述步骤(I)的具体操作为A、取0. Ig柑橘叶片,液氮充分研磨后加入预先放置有ImlTranzol up溶液的微型离心管中，涡旋混匀lmin，然后室温放置5-lOmin将上述微型离心管在WOOOrpm，4°C下离心 15min ；B、取上清液Iml置于第二只微型离心管中，并在其中加入氯仿200iiL或I-溴-3-氯丙烷100 u L，用手摇15s，然后在室温或4°C放置IOmin ；C、将第二只微型离心管在12000rpm，4°C下离心IOmin后，再取上清液650 u L加入第三只微型离心管中，加入585-650 u L的异丙醇,颠倒混勻，-20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下离心IOmin,弃上清液,再离心15s用枪头吸弃上清液；D、在第三只微型离心管中加入用DEPC水配制的75%的こ醇溶液1ml，该こ醇溶液的温度为-20°C,颠倒、润旋至混勻，然后在8000rpm,4°C下离心3min,弃上清液,再离心15s，用枪头吸弃上清液； E、按照步骤D的方法再洗涤一次沉淀，然后将RNA沉淀置于通风橱中室温干燥 2-3min，然后加入 50 y L-100 u L DEPC 水或 DEPC 水配 I XTE 溶解 RNA，55-60 °C 孵育3-5min)，轻轻涡旋混匀，得到模板RNA溶液。有益效果本专利技术的RT-LAMP检测方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需电泳及特殊仪器，便于在田间大规模应用，该方法为CTLV病害监测构建了一个快速检测的技术平台。说明书附I为本专利技术特异性的琼脂糖凝胶电泳图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柑橘碎叶病毒的RT?LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，其特征在于：所述特异性引物组为以下四组中的任意一组：第一组omp?FIP5′?AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA?3′omp?BIP5′?CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC?3′omp?F35′?GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA?3′omp?B35′?CATCAGGTGTTAGACGATTCA?3′；第二组omp?FIP5′?AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT?3′omp?BIP5′?TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC?3′omp?F35′?AGAAAGCCAGAGAAGGGT?3′omp?B35′?CATCAGGTGTTAGACGATTCA?3′；第三组omp?FIP5′?GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC?3′omp?BIP5′?TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG?3′omp?F35′?GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA?3′omp?B?35′?GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC?3′；第四组omp?FIP5′?ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT?AAAATGAATCGTCTAACACCTGA?3′omp?BIP5′?AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG?TTGCGGAATTTTAAACGACTC?3′omp?F35′?ATTTGATTTTGCTACTGGTCT?3′omp?B35′?ATGTCAACCTGCAAGACC?3′。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：段硕，周常勇，李敏，宋震，李中安，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：