本发明专利技术公开了一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术的专用引物适用于对西尼罗病毒进行特异性检测。本发明专利技术的优点：(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明专利技术特别适用于临床标本和野外现场标本的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉 及一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
西尼罗病毒感染导致的西尼罗热是蚊媒传播的人畜共患病。多数患者呈亚临床症状，约20%感染者会在3-14d后出现西尼罗热。其病症可能包括发烧、头痛、身体疼痛、淋巴腺肿胀，有时有出疹症状。病症通常持续约一周。西尼罗病毒感染可导致病毒性脑炎，引起高烧、头痛、神志错乱、虚弱无力，有时亦会出现麻痹，偶然会导致死亡。西尼罗病毒1999年以前主要在非洲、中东、西亚和欧洲流行。1996年罗马尼亚暴发欧洲首次西尼罗热大流行。流行集中在多瑙河流域的14个地区，病毒感染率约为1214/10万。1999年俄罗斯南部也暴发大范围西尼罗脑炎流行，约有1000病例，至少40人死亡。1999年美国首次爆发西尼罗热流行，这是西半球首次西尼罗热流行。自此，美国历年均暴发西尼罗热/西尼罗脑炎流行，且西尼罗病毒分布已从1999年4个州蔓延到2004年近50个州，并传播到加拿大中南部和加勒比海地区。时至今日，西尼罗病毒感染已成为全球性严重的公共卫生健康问题。西尼罗脑炎诊断主要依赖检测病毒及其抗体，由于病毒血症时病毒载量低，且恢复期病毒已被清除，因此从血液或者脑脊液中分离病毒较为困难。新的诊断技术包括用ELISA方法测抗原、或者用PCR和实时PCR测定西尼罗病毒核酸。其中实时PCR是这些诊断技术方法中最为敏感的，但仍不能检测出所有的西尼罗脑炎患者。传统的这些方法等常需要花费较长时间或者需要特定的仪器，难以满足暴发疫情快速诊断的需要。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBR green I染料或者与钙黄绿素指示LAMP反应。SYBRgreen I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn2+结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg2+游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。由于LAMP方法试验要求条件低，结果易于判断，非常适宜基层病毒的排查，开展及时的动物卫生防控工作。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测西尼罗病毒的专用引物。本专利技术提供的专用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。所述专用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成；所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端还可根据靶序列进行延长；所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。本专利技术的第二个目的是提供一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂。本专利技术提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲 液、所述的专用引物。所述扩增试剂还包括钙黄绿素；所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；所述的专用引物中的引物I和引物2在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L ;所述的专用引物中的引物3和引物4在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L ;所述的专用引物中的引物5在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为20pmol/L ；所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10 yg以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 004U/ μ L ；所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 32U/ μ L ；所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50 μ mol/L ；所述2X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵((NH4)2SO4)、吐温 20 (Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)和dNTPs (脱氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；在所述2 X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为O. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述脱氧核苷三磷酸的浓度均为2. 8mmol/Lo所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。本专利技术的第三个目的是提供一种检测西尼罗病毒的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括所述的环介导等温扩增试剂；所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定西尼罗病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中西尼罗病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤用所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物；所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；所述环介导等温扩增反应条件为先60°C _65°C反应35-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应条件为先63°C反应45min或60min,然后75°C 2min终止反应；所述待测样本为小鼠的脑。本专利技术的检测对象不局限于小鼠脑组织样本，还可涉及蚊虫样本、动物或人的血清、脑脊液、尸解脑组织或脏器组织等；所述西尼罗病毒为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下I) _4)中的至少一种I)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有亮黄色荧光，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒；2)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若有特异扩增曲线，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若无特异扩增曲线，则待测样本中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测西尼罗病毒的专用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦成峰，姜涛，刘娟，李晓峰，邓永强，秦鄂德，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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