本发明专利技术公开了一种检测BYD病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本发明专利技术的专用引物适用于对BYD病毒进行特异性检测。本发明专利技术的优点：(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测BYD病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
BYD病毒，以其分离地白洋淀(Bai Yang Dian)首字母命名，属黄病毒属成员，与Tembusu病毒亲缘关系较近，该病毒感染鸭后可导致鸭产蛋下降综合征(Duck Egg-DropSyndrome，DEDS)。该病于2010年首次发现，传染性非常强。病鸭主要病症为高热、食欲废绝、产蛋下降甚至停止，发病较重的鸭禽甚至丧失行动能力，剖检可见卵巢发生出血、萎缩、破裂等严重病变。我国沿海鸭禽养殖省区包括北京、安徽、河北、福建、广东，广西、江苏、江西、山东、浙江均有流行，无论肉鸭还是蛋鸭均可被该病毒感染，死亡率为5 15%，给各地鸭禽养殖业造成重大经济损失。·该病尚无有效的检测手段，血清学上与我国常见黄病毒如登革病毒、日本脑炎病毒等存在一定的血清学交叉反应，目前仅有文献报道采用普通逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测该病原。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用特异引物在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断大量复制扩增核酸。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBRgreen I染料或者钙黄绿素指示LAMP反应。SYBR green I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn2+结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg2+游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测BYD病毒的专用引物。本专利技术提供的专用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。所述专用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成。所述BYD病毒具体为BYD病毒Bydl株。所述专用引物中，F3(引物1)、B3(引物2)、FIP(引物3)、BIP(引物4)和LB(弓I物5)还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT (下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。本专利技术的第二个目的是提供一种检测BYD病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂。本专利技术提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物。所述扩增试剂还包括钙黄绿素；所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；所述的专用引物中的引物I和引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为5pmol/L ;所述的专用引物中的引物3和引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为40pmol/L ;所述的专用引物中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为20pmol/·L ；所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10 μ g以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 004U/ μ L ；所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 32U/ μ L ；所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50 μ mol/L ；所述2X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵((NH4)2SO4)、吐温 20 (Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)和dNTPs (脱氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；在所述2 X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为O. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为I. 6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述dNTP的浓度均为2. 8mmol/L0所述BYD病毒为BYD病毒Bydl株。本专利技术的第三个目的是提供一种检测BYD病毒的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括所述的环介导等温扩增试剂；所述BYD病毒具体为BYD病毒Bydl株。所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定BYD病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。所述BYD病毒具体为BYD病毒Bydl株。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中BYD病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤用所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物；所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；所述环介导等温扩增反应条件为先60°C -65°C反应30-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应条件为先63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应；所述待测样本为鸭的肝； 本专利技术的检测对象不局限于鸭的肝，还可涉及鸭的各种脏器，血液标本，粪便标本，以及密切接触者(人)的相关样本。所述BYD病毒为BYD病毒Bydl株。所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下I)-4)中的至少一种I)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有荧光(黄绿色荧光)，则待测样本中含有或者候选含有BYD病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有BYD病毒；2)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若有特异扩增曲线，则待测样本中含有或者候选含有BYD病毒；若无特异扩增曲线，则待测样本中不含有或者候选不含有BYD病毒；3)电泳检测所述环介导等温扩增反应产物，得到梯度样条带的扩增反应产物，则待测样本中含有或者候选含有BYD病毒；若环介导等温扩增反应产物不为梯度样条带，则待测样本中不含有或者候选不含有BYD病毒；所述梯度样条带的大小为200bp_2000bp，所述梯度样条带的大小主要分布在200bp-2000bp 间；4)用Xho I酶切所述环介导等温扩增反应产物，电泳检测所述酶切产物，若所述酶切产物为318bp产物和206bp产物，则待测样本中含有或者候选含有BYD病毒；若所述酶切产物不为318bp产物和206bp产物，则待测样本中不含有或者候选不含有BYD病毒。所述检测环介导等温扩增反应产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测BYD病毒的专用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦成峰，姜涛，刘娟，邓永强，秦鄂德，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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