一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，以在鲫鱼肠道细胞中调控营养物质消化吸收的关键转录因子CDX2的表达作为分析鲫鱼消化吸收率的依据，根据其荧光定量PCR结果来进行分子水平的分析，既涵盖传统的消化吸收率评定方法，又提出了更为方便的基因分析来进行评定：选择鲫鱼肠道细胞中CDX2基因的定量表达结果与传统湿式灰化定量法测的鲫鱼表观消化率呈正相关作为评定依据。与传统方法相比，本发明专利技术可以从分子水平准确的对鲫鱼表观消化率和以后的肠道消化吸收潜能进行评定，方法简单、方便，能够为鲫鱼饲料配方优化提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鲫鱼消化吸收率分析
，涉及ー种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法。
技术介绍
鱼类对饲料中营养物质的充分利用是鱼类快速生长的必要条件，因此其对营养物质的消化吸收直接影响鱼类生产性能的提高。在饲料配方中，把鲫鱼对饲料的消化吸收率进行准确评价以选择优良饲料是确保鲫鱼高效养殖的重要前提。消化吸收率是评价饲料营养价值的重要指标之一。而目前对其研究的方法主要有两种体外消化法和体内消化法。体外消化法虽简便但无法反映体内消化的真实情况，所以缺乏可靠性，已很少采用。体内试验法又分为直接法和间接法两种。直接法由于工作量太·大而没有间接法那样应用广泛。无论是直接法还是间接法，都存在粪便的收集问题，操作繁琐。相关研究发现，⑶X2作为ー种肠道上皮细胞特异性核转录因子，对肠道发育以及营养物质在肠道内消化吸收起着关键性作用。它调控了机体内糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢和矿物元素代谢等相关功能基因的表达，并对肠道上皮细胞増殖、分化具有重要的调节作用。在实践中发现，CDX2基因的相对表达量随着鲫鱼消化吸收率的升高而升高，降低而降低。于是就产生了用⑶X2基因作为鲫鱼消化吸收率的ー个分子标志，进而用来评价鲫鱼对某种饲料消化吸收的程度，具有重要的理论指导意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该方法能够对鲫鱼的消化吸收率进行准确的评定并能预测其以后肠道消化吸收的潜力，为鲫鱼的饲料配方优化提供技术支持。本专利技术提供的技术方案是包括以下步骤(I)取待检测的鲫鱼，解剖井分离出肠道，将肠道投入保存液中，以用于基因表达的分析； (2 )提取第(I)步中的肠道总RNA ； (3)反转录合成cDNA； (4)以第(3)步中的cDNA为模板，用CDX2引物进行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示,下游核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； (5 )实时荧光定量PCR检测，其中，目的基因引物为所述的CDX2引物，荧光定量内參基因引物为管家基因P-Actin引物，该引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； (6)定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，计算CDX2基因的表达量，CDX2基因的表达量=2_AA ，其中A A Ct= (Ct目的基因-Ct管家基因)-A Ct校准样，根据⑶X2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。上述的基因分析方法，第(4)步cDNA片段克隆的PCR反应体系2XPCR Taq Mix12.5 ML，上、下游引物各I ML，cDNA I ML，ddH20加至25 ML ;PCR反应流程94で预变性3 min，95°C变性 30 s，55°C退火 20 s，72°C延伸 20 s，35 个循环，72 °C延伸 10 min,4°C 10min0上述的基因分析方法，第(5)步实时荧光定量PCR检测，按照SYBR Green I染料法要求，ニ步法进行定量PCR，反应体系Takara SYBR Premix Ex Taq 12. 5 ML、浓度10PM的上下游引物各0.5 ML、cDNA 2 ML、ddH20加至25 ML，反应程序95 V 30 s，95 V 3 s、55 °C 25 s、72 °C 11 s 共40个循环，95 °C I min、55 °C 30 s、95 °C 30 s 终止，4 °C保存。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果 (I)本专利技术提供的用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，将传统的化学分析方法提高到分子水平的基因分析方法，操作简单且准确率高。(2)以肠道上皮细胞特异性核转录因子⑶X2基因的表达作为鲫鱼肠道消化吸收率的评定方法，根据其表达量的高低来进行鲫鱼消化吸收率的分析，不但可以从分子水平快速方便对鲫鱼消化吸收率进行评定，还可以对其以后肠道消化吸收的潜能进行评定，方法简单且准确率高，能够为鲫鱼饲料配方优化提供技术支持。附图说明图I :丁酸钠对鲫鱼肠道CDX2基因相对表达量的影响； 图2 :CDX2基因的相对表达量与干物质表观消化率建立的数学模型。具体实施例方式下面通过具体实施方式的详细描述来进ー步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限制，仅仅作示例说明。本专利技术提供，通过对肠道上皮细胞特异性核转录因子CDX2基因进行定量PCR表达分析，根据其在鲫鱼肠道中的表达量，进而从分子水平上评定鲫鱼的消化吸收率，下面检测丁酸钠对鲫鱼肠道CDX2基因表达量和消化吸收率的影响。以初始体重(6. 02±0. 16)ダ的鲫鱼为研究对象，在鲫鱼基础饲料中分别添加0. 0g/kg、1.0 g/kg、2.5 g/kg、5. 0 g/kg、7. 5 g/kg的包膜丁酸钠,配制5种等氮等能的实验饲料。饲料配方如下各原料组份按重量百分比为面粉8%、淀粉20%、豆柏32%、鱼粉28%、豆油3%、鱼油3%、氯化胆碱0. 5%、磷酸ニ氢钙1%、三氧化ニ铬0. 5%、甲基纤维素2%、预混料2%。其中预混料可为每公斤饲料提供VA 20 mg ^B1 10 mg ；VB2 15 mg ；VB6 15 mg ；VB128 mg ；烟酸胺 100 mg ；VC(35%) 1000 mg ;泛酸I丐 40 mg ;生物素 2 mg ;肌醇 200 mg ;叶酸 10 mg ；VE 400 mg ；VK 320 mg ；VD 310 mg ；MgS04 7H20 600 mg ；ZnSO4 7H20 600 mg ；MnS04 7H2080 mg ；ki I. 5 mg ；Na2Se03 3 mg ；CoCl *6H20(10%) 5 mg ；CuSO4 *5H20 30 mg ；NaCl 100 mg ；次粉150 mg ;沸石粉4780. 5mg ;抗氧化剂200 mg。研究不同浓度包膜丁酸钠通过促进鲫鱼肠细胞增殖对其生长作用的影响。实验在室内养殖系统中进行，每水族缸饲喂30尾 ，每处理组3个重复，以鱼体重3% — 5%投喂量，日投喂3次，试验持续7周。其中，对照组投喂的饲料中包膜丁酸钠含量为0.0 g/kg，四个实验组投喂的饲料中包膜丁酸钠含量分别为L 0 g/kg、2. 5 g/kg、5.0 g/kg、7. 5 g/kg。试验结束后，用本专利技术检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，对上述各组的鲫鱼进行基因表达分析，具体过程如下 (1)随机取待检测的鲫鱼3尾，在冰盘上解剖井分离出肠道，样品迅速投入RNAfixer(RNA fixer购自北京百泰克生物技术有限公司)保存液中，用于基因表达的分析； (2)从NCBI中查询并下载斑马鱼(NM_001098762)、塞内加尔多鳍鱼(DQ522900)的⑶X2基因序列，DNAMAN软件查找基因的同源保守区。用Primer Premier 5. 0软件设计引物，用于下面步骤CDX2基因的cDNA片段克隆和实时荧光定量PCR检测。參照金鱼管家基因3-actin(AB039726)设计内參引物Actin，作为荧光定量内參基因引物，设计的两对引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取待检测的鲫鱼，解剖并分离出肠道，将肠道投入保存液中，以用于基因表达的分析；（2）提取第（1）步中的肠道总RNA；（3）反转录合成cDNA；（4）以第（3）步中的cDNA为模板，用CDX2引物进行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，下游核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；（5）实时荧光定量PCR检测，其中，目的基因引物为所述的CDX2引物，荧光定量内参基因引物为管家基因β?Actin引物，该引物的上游核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，下游核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；（6）定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，计算CDX2基因的表达量，CDX2基因的表达量=2?ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因?Ct管家基因)??ΔCt校准样，根据CDX2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘臻，鲁双庆，周毅，孙浪，
申请(专利权)人：长沙学院，
类型：发明
国别省市：