解脲脲原体和微小脲原体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种解脲脲原体和微小脲原体的检测方法，属于微孔反应板的检测技术。本发明专利技术是在包被有Uu和Up特异性探针的DNA-BINDING96孔测定板微孔内，分别加入经PCR扩增后热变性处理的临床样本，另外设立分别加入Uu、Up血清型标准株PCR扩增后热变性处理的阳性对照孔；经温箱杂交后洗板，拍干；每孔加入链亲和素辣根过氧化物酶结合物，后经洗板，晾干；每孔加入显色底物A、B，混匀后暗处显色，最后加入终止液，以颜色变化判断结果。本发明专利技术不仅解决了以液体培养基颜色改变判断阳性结果出现假阳性的问题，还能准确地进行Uu和Up的鉴别，提高了检测的敏感度，同时也实现了高通量的检测，可广泛用于临床筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微孔反应板的检测技术，具体是一种解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum, Uu)和微小脲原体(Ureaplasma parvum, Up)的检测方法。
技术介绍
支原体(Mycoplasma)是一类介于细菌和病毒之间，没有细胞壁，能通过细菌滤器，能在人工培养基上生长繁殖的最小原核生物 。支原体归属于柔膜体纲，支原体目，支原体科。支原体科分为支原体，血虫体，血巴尔通体和脲原体4个属。其中，多项研究证明脲原体属的解脲脲原体与女性泌尿生殖道的非淋菌性尿道炎、流产、早产、低体重儿等密切相关。Janet等于1984年报道金属锰离子对Uu有抑制作用。ImM锰离子不仅抑制解脲脲原体在液体培养基中的生长或减少其生长比例，同时也改变其菌落形态和细胞的超微结构。然而这种抑制效应是独立的而且具有种特异性，正是由于这种差别，Janet把解脲脲原体划分为两种生物群即 parvum群(Ureaplasma parvum, Up)和urealyticum群(Ureaplasmaurealyticum, Uu)(对于parvum群,猛离子对其生长的抑制是短暂的而对于urealyticum群却是永久的。)。这是最早的对Uu和Up的划分。随着分子生物学的发展，从基因水平对脲原体进行了在系统发生学上的深入研究，Kong等报道在16SrRNA基因序列上Uu和Up存在1%位点的差异特别是在176、177和180-183位点，而它们的各血清型之间却是一致的。同时Kong也对Uu和Up的16_23SrRNA基因间隔区进行了比对，发现它们之间有14个碱基的差别，而内部各血清型之间也是相似的。随后Uu和Up之间在脲酶基因、MBA抗原、基因大小等处的差异也相继报道，从而进一步提出了 Up作为一个独立的新种即微小脲原体命名的观点。在临床致病性上，张帝开等研究表明，在健康妇女中Up为主要的脲原体(82. 5%)，且以血清1、3、6型的单型别阳性为主(共占87. 1%)。KONG等用宫颈拭子直接用PCR法检测解脲脲原体，共调查了 100例孕妇，解脲脲原体总体阳性率58%，其中Up占91. 4 %。这个提示Up是正常人群携带菌的可能性较大。与此同时有研究指出，Uu和Up的毒力不同，其致病性亦不同，Uu或其中的某个血清型更容易致病。有学者认为Uu产脲酶量多，与Up相比，对宿主细胞的毒性更大，致病性更强。因此，2007年国际细菌学分类学会正式做出把解脲脲原体原来的parvum群分出独立命名为新的物种微小脲原体而urealyticum群仍保留原解脲脲原体命名的决定。当前在我国临床对解脲脲原体的检测主要是培养法，以液体培养基颜色变红诊断为阳性。然而，泌尿生殖道中常含有其他具有脲酶基因的微生物(如，变形杆菌、衣原体等)均可导致培养基变红，故以培养基颜色判读结果常出现假阳性的情况。同时，由于传统的培养方法只能检测出有脲原体的存在而不能准确对其进行Uu和Up的鉴别，这就限制了不同物种与临床疾病关系的研究和流行病学的调查。因此，建立一种准确、快速同时能进行Uu和Up检测鉴定的方法将具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决以液体培养基颜色改变判断阳性结果的常规培养法出现假阳性结果，且不能准确对其进行Uu和Up鉴别的问题，而提供的一种具有重要的临床意义的。本专利技术是按以下技术方案实现的。一种，其是按以下步骤进行的 ①.在分别包被有Uu和Up特异性探针的DNA-BINDING96孔测定板微孔内，分别加入20 μ I经PCR扩增后热变性处理的临床样本； 另将分别包被有Uu和Up特异性探针的DNA-BINDING96孔测定板4个阳性对照孔内，分别加入经PCR扩增后热变性处理的Uu血清型8标准株产物和Up血清型3标准株产物各20μ I ； 上述各孔分别加180 μ I杂交液混匀，65 1温箱杂交60min，弃液后，用O. 1%SDS洗液II、TBST洗板，弃液拍干； ②.每孔加入链霉亲和素辣根过氧化物酶封闭液I: 1000稀释的混合物50 μ I，室温放置30分钟，用TBST洗板后加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分钟；再用TBST洗涤，晾干； ③.每孔各加入显色底物Α、B各50μ I，混匀后置于暗处显色20分钟，最后加入终止液50 μ I,以颜色变化判断结果； ④.经PCR扩增后热变性处理的临床样本加入终止液后，包被Uu探针的孔变黄或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于O. 500，而包被Up探针的孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于O. 200则证明Uu阳性； 包被Uu探针的孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于O. 200，而包被Up探针的孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于O. 500则证明Up阳性；Uu、Up探针孔同时为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均大于O. 500则证明同时感染Uu和Up ；而同时为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均小于O. 200则证明无Uu和Up感染；Uu阳性对照Uu探针孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于O. 500，Up探针孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于O. 200 ； Up阳性对照Uu探针孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于O. 200，Up探针孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于O. 500。所述，其所述PCR扩增后热变性处理的临床样本，是将女性受检者宫颈和阴道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，经PCR扩增后，100 1水浴变性10分钟后，立即冰浴5分钟获得的； 所述，其所述经PCR扩增后热变性处理的Uu血清型8标准株产物和Up血清型3标准株产物，是经100 1水浴变性10分钟后，立即冰浴5分钟获得的。所述一种，其Uu特异性探针的核酸序列为5’ NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3’。所述一种，其Up特异性探针的核酸序列为5’ NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3’。这样设计的本专利技术，在对扩增产物的观测上，采用基于DNA-BINDING96孔板的微反应板的核酸杂交反应进行PCR产物的检测。该反应过程，与传统的PCR产物电泳检测相t匕，提高了检测的敏感度，同时也实现了高通量的检测，不仅解决以液体培养基颜色改变判断阳性结果出现假阳性结果的问题，还能准确地进行Uu和Up的鉴别，可广泛用于临床筛查。附图说明附图是本专利技术吸光度值坐标图。具体实施方案 下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细说明。I.标本女性的宫颈和阴道分泌物；男性首段尿IOml ；Uu,Up阳性对照Up血清型3标准菌株(ATCC 27815)和Uu血清型8标准菌株(ATCC27618),购自 American Type Culture Collection, ATCC。2.标本核酸DNA的提取 a.用无菌棉拭子分别采集女性的宫颈和阴道分泌物，洗脱在磷酸缓冲液(PBS:磷酸二氢钾(KH2P04) :0. 27g，磷酸氢二钠(Na2HP04) :1.42g，氯化钠(NaCl) :8g，氯化钾(KCl) O. 2g,加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解脲脲原体和微小脲原体的检测方法，其是按以下步骤进行的：①.在分别包被有Uu和Up特异性探针的DNA?BINDING96孔测定板微孔内，分别加入20μl经PCR扩增后热变性处理的临床样本；另将分别包被有Uu和Up特异性探针的DNA?BINDING96孔测定板4个阳性对照孔内，分别加入经PCR扩增后热变性处理的Uu血清型8标准株产物和Up血清型3标准株产物各20μl；上述各孔分别加180μl杂交液混匀，65?℃温箱杂交60min，弃液后，用0.1%SDS洗液Ⅱ、TBST洗板，弃液拍干；????②.每孔加入链亲和素辣根过氧化物酶∶封闭液1∶1000稀释的混合物50μl?,室温放置30分钟，用200μl?TBST洗板后加入含1%SDS的洗液Ⅱ浸泡15分钟；再用TBST洗涤，晾干；③.每孔各加入显色底物A、B各50μl?,混匀后置于暗处显色20分钟,最后加入终止液50μl,以颜色变化判断结果；④.经PCR扩增后热变性处理的临床样本加入终止液后，包被Uu探针的孔变黄或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于0.500，而同时包被Up探针的孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于0.200则证明Uu阳性；包被Uu探针的孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于0.200，而同时包被Up探针的孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值大于0.500则证明Up阳性；Uu、Up探针孔同时为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均大于0.500则证明同时感染Uu和Up；而同时为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均小于0.200则证明无Uu和Up感染；Uu阳性对照??Uu探针孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均大于0.500，Up探针孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于0.200；Up阳性对照??Uu探针孔为无色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值小于0.200，Up探针孔为黄色或经酶标仪在450nm处测定吸光度值均大于0.500。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘运德，王蓉，李雪，张楠，谷亚军，鲍会静，齐新，李建，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：