快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。本发明专利技术提供了一种特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列2所示单链DNA分子和序列3所示单链DNA分子组成。所述特异引物组合物可用以如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。本发明专利技术提供的特异引物组合物及其应用对于监测小菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂的抗性基因频率和对双酰胺类杀虫剂抗药性发生发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。
技术介绍
小菜蛾(Plutella xylostella)属于鱗翅目菜蛾科，英文名为“Diamondbackmoth”，是一种对十字花科植物危害极大的害虫，全国各地均有分布，在我国南方地区常年造成严重危害。目前对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。以氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺为代表品种的双酰胺类杀虫剂对鳞翅目害虫有很好的防治效果。其作用机制独特，通过激活昆虫鱼尼丁受体，导致细胞质钙库中的钙离子大量释放，引起肌肉强烈收缩，从而使害虫立即停止取食，活动能力减弱，肌肉瘫痪最终导致死亡。氯虫苯甲酰胺自2008年在中国正式登记后，很快被大面积用于防治包括小菜蛾在内的多种鳞翅目害虫。但2010年就已经发现广州田间小菜蛾种群对该药产生了数十倍的抗性，2011年更发现抗性高达2000多倍。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。本专利技术提供了一种特异引物组合物，由序列表的序列I所示单链DNA分子、序列表的序列2所不单链DNA分子和序列表的序列3所不单链DNA分子组成。本专利技术还保护所述特异引物组合物在制备试剂盒中的应用；所示试剂盒的用途为如下(a)或(b): (a)鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A ； (b)辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。本专利技术还保护包括所述特异引物组合物的试剂盒；所示试剂盒的用途为如下(a)或(b): (a)鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A ;(b)辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。本专利技术还保护所述特异引物组合物的应用，为如下(a)或(b):(a)鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A ; (b)辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。本专利技术还保护一种鉴定小菜蛾针对G4899E突变的基因型的方法，包括以下步骤以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了 70±5bp (如70bp)的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp (如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾为GG基因型；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了 70±5bp (如70bp)的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp (如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾为AA基因型；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了 70±5bp(如70bp)的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp(如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾为GA基因型；所述敏感引物对由序列表的序列I所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A。GG基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性。GA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾对于双酰胺类杀虫剂的抗性闻于GG基因型的小采蛾和GA基因型的小采蛾。本专利技术还保护一种辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性的方法，包括以下步骤以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了 70±5bp (如70bp)的扩增产物同时采用所述抗性·引物对时没有扩增得到70±5bp (如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了 70±5bp (如70bp)的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp (如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了 70±5bp (如70bp)的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp (如70bp)的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫敏感；所述敏感引物对由序列表的序列I所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。所述对双酰胺类杀虫剂敏感指的是待测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的LC5tl值低于O. lmg/L。所述对双酰胺类杀虫剂具有抗性指的是待测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的LC5tl值高于O. lmg/L、高于lmg/L、高于10mg/L或高于38mg/L。以上任一所述小菜蛾的鱼尼丁受体基因的开放阅读框可为如下如下I)或2)或3)的DNA分子I)序列表中序列4自5’末端第313至15666位核苷酸所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子;3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。本专利技术提供的特异引物组合物能够有效鉴定出小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变，从而判断小菜蛾对于双酰胺类杀虫剂的抗性或敏感性，具有快速有效、灵敏度高、能处理大批样本的优点，对于监测小菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂的抗性基因频率和对双酰胺类杀虫剂抗药性发生发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。附图说明图I为以第一组小菜蛾的个体(氯虫苯甲酰胺敏感型个体)为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为以第二组小菜蛾的个体(氯虫苯甲酰胺高抗型个体)为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验·方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例I、分析对双酰胺类杀虫剂抗感性不同的小菜蛾个体的鱼尼丁受体基因，从而发现并验证鱼尼丁受体基因G4899E突变与抗感性的关系对2011年采自广东省广州市田间的100个小菜蛾个体进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁沛，郭磊，高希武，史雪岩，宋敦伦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：