通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊或猪的胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素β6亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫中，得到的子代即为整合素β6亚基基因被敲除的杂合子转基因羊或猪。杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因羊或猪。用本方法获得的转基因羊或猪低表达或不表达口蹄疫病毒受体整合素β6亚基，使FMDV感染率明显下降，其具备了抗FMD的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物转基因技术，尤其涉及一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素(Integrin)β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，属于细胞工程领域。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首。一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物，不仅会造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除、沉默或封闭病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。FMDV体外感染的受体包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及细胞培养适应毒株可利用HSPGs感染体外培养的细胞(O’Donnell等，2008)，但HSPGs可能只作为一种附属分子增强其它受体的效率，尚无证据表明其在FMDV野毒株感染细胞过程中起作用(Monaghan等，2005)。整合素αv亚家族成员中αvβ1、αvβ3、αvβ6及αvβ8是FMDV感染体外细胞的表面受体(Gutiérrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005；Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Sáenz等，2009；Johns等，2009)，其中整合素受体β6亚基是启动FMDV强毒自然感染的关键性β受体亚基，原因在于：(1)FMDV主要经上呼吸道感染动物，在口咽或相关淋巴组织的上皮细胞起始复制后迅速扩散到口部和蹄部的上皮细胞。在4种整合素受体中，只有αvβ6仅限于FMDV组织嗜性的上皮细胞表面持续且高水平的表达(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮细胞可同时检测出αvβ6和病毒抗原(O′Donnell等，2009)。(2)体外合成的αvβ6可与所有血清型的FMDV结合(Ferris等，2005)，并且亲和力最强(Burman等，2006)，这不仅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亚基成为FMDV整合素受体中利用率最高的β亚基(Duque等，2003)。(3)不仅FMDV非敏感细胞转染β6亚基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗体可抑制受体与病毒间的结合并阻断病毒感染(等，2007；Jackson等，2000)。转基因动物的制作方法主要有逆转录病毒法、受精卵原核显微注射法、精子载体法、ES细胞技术和转基因体细胞核移植技术等，其中受精卵原核显微注射法和转基因体细胞克隆是目前世界各国科学家比较常用的家畜转基因技术。转基因体细胞克隆技术是基因组修饰技术与动物体细胞核移植技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，它部分地克服了传统转基因动物外源基因整合率低、大动物生产成本高的技术瓶颈，代表当前转基因动物制作的主流方向，利用该方法已经相继克隆出转基因牛、山羊和猪等。基因打靶是在胚胎干细胞和同源重组技术基础上产生的，是改变生物体遗传信息的转基因技术，包括通过同源重组将外源基因/修饰的自身基因定点整合到受体细胞基因组(knock in)及将宿主细胞特定基因区段敲除(knock out)。该技术在小鼠转基因中被广泛应用，但是，由于大动物没有公认的家畜ES干细胞系而无法在ES干细胞水平上进行基因打靶，1997年多莉羊的诞生为体细胞基因打靶制备转基因动物开辟了新的途径。用体细胞介导的基因打靶技术制备转基因动物突出的优点是：(1)可以避开复杂的ES细胞技术；(2)可以不经过嵌合体中间步骤；(3)可以控制转基因动物性别；(4)能够在体细胞体外培养水平进行整合筛选和基因打靶，因而可以显著降低制备转基因动物，特别是转基因家畜的成本，在生物
具广阔前景。尽管体细胞体外培养传代的有限性是体细胞基因打靶研究的难点并且成功率低，但是近年来体细胞基因打靶研究也获得了一些突破性进展。2000年，McCreath等首次将α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到绵羊胎儿成纤维细胞的a1原胶原基因座上，获得了AAT较高表达水平的转基因克隆绵羊。随后，国内外科学家相继利用体细胞克隆和基因打靶手段研制出不同的转基因动物。Yu等(2006)报道利用基因打靶技术获得敲除了朊病毒一个PrP基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观察这些基因敲除羊没有异常表现。Richt等(2007)利用基因打靶技术灭活牛的PRNP基因，获得生长发育正常、存活2年以上的转基因牛，它们能够很好地抵抗疯牛病的传染。参考文献：1.Berryman S，Clark S，Monaghan P，Jackson T.Early Events in Integrin αVβ6-Mediated Cell Entry of Foot-and-Mouth Disease Virus，J Virol.，2005，79(13)：8519-34.2.Burman A，Clark S，Abrescia NG，Fry EE，Stuart DI，Jackson T.Specificity of the VP1 GH loop of Foot-and-Mouth Disease virus for alphav integrins，J Virol.，2006，80(19)：9798-810.3.Brown JK，McAleese SM，Thornton EM，Pate JA，Schock A，Macrae AI，Scott PR，Miller HR，Collie DD.(2006).Integrin-alphavbeta6，a putative receptor for foot-and-mouth disease virus，is constitutively expressed in ruminant airways，J Histochem 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其
特征在于：是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊
或猪的胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素β6亚基基因的核供体细胞，将核
供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫
中，得到的子代即为整合素β6亚基基因被敲除的杂合子转基因羊或猪。
2.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因
羊或猪的方法，其特征在于，还包括以下方法：杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞
克隆获得纯合子转基因羊或猪；
或：杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配繁殖而获得纯合子转基因羊或猪。
3.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转
基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊为绵羊或山羊。
4.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转
基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊或猪胎儿成纤维细胞为35～50日龄胎儿不同组织
来源的成纤维细胞。
5.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转
基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊或猪胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，王洪梅，武建明，刘蓝，吕洋，杨宏军，宋玲玲，孙涛，高运东，侯明海，仲跻峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：