利用重组病毒分析法评价病毒受体/辅助受体使用和病毒侵入抑制剂的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法。该方法包括：（ａ）从感染病毒的病人体内获得编码病毒包膜蛋白的核酸；（ｂ）将（ｉ）步骤（ａ）中的核酸和（ｉｉ）缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞；（ｃ）在化合物存在的条件下，将步骤（ｂ）中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；（ｄ）测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和（ｅ）将步骤（ｄ）中产生的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中化合物存在时信号量的减少意味着化合物抑制了病毒向第二细胞的侵入。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
在本申请中，以作者和日期的形式引用了各种出版物。在权利要求书之前、说明书的末尾以字母顺序列出了这些出版物的完整引文。包括前文和后文引用的所有专利、专利申请和出版物都作为一个整体在本文中引入作为参考。由此，为了更全面地介绍在完成本专利技术时本领域技术人员所了解的本领域技术现状，这些出版物的内容作为整体在本申请中引入作为参考。
技术介绍
病毒侵入是抗病毒治疗的一个令人关注的新目标，大约有10个用于阻断病毒接触或膜融合的药物处于临床前研究或临床研究阶段(Richman，1998；PhRMA，1999；Stephenson，1999)。带有包膜的动物病毒和宿主细胞接触，并通过病毒颗粒膜上病毒蛋白(包膜蛋白)和细胞表面蛋白(病毒受体)的相互作用侵入宿主细胞。受体识别和结合由表面的包膜蛋白所介导。专利技术概述相应地，本专利技术的目的之一是提供用于检测病毒对病毒侵入抑制剂敏感性的一种快捷、灵敏的表型分析法。本专利技术的另一个目的是提供一种逆转录病毒载体系统，该系统产生的病毒颗粒包含各种来源的病毒包膜蛋白，并能够识别表达有病毒受体、允许病毒复制的细胞系。本专利技术的另一个目的是提供一种能够接受病人来源的、编码包膜的基因片段的病毒包膜表达载体。本专利技术的另一个目的是提供一种包含HIV-1病毒基因组大部分的、在包膜区位置带有荧光素酶报道基因的生物安全性载体。本专利技术的另一个目的是提供一种表型分析方法，该方法通过使用HIV-1基因组中转录调控区(U3的3′拷贝)缺失了的病毒表达载体，减小了形成重组的感染性HIV-1的可能性。本专利技术的另一个目的是提供一种能够鉴定并测定受体/辅助受体向性(tropism)的分析方法，该方法能够快捷、准确地鉴定感染了向性病毒(tropic virus)毒株的病人。本专利技术的这些目的和其他目的可通过以下实现一种鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，其包括(a)从感染了病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸、包含能产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中测定的信号量和无化合物存在时产生的信号量相比较，其中化合物存在时信号量的减少意味着化合物抑制了病毒向第二细胞的侵入。附图简述本专利技术的文件中至少含有一份彩图。专利商标局可以应要求提供带有彩图的本专利的复本，并收取相应的费用。附图说明图1A.包膜表达载体和病毒表达载体的结构。HIV包膜表达载体(pHIUVenv)含有从病人血浆样本扩增得到的包膜序列。a/b和c/d指位于HIV-1包膜多聚蛋白(gp160)基因5′和3′末端的限制性内切酶位点。HIV表达载体(pHIVlucAU3)编码除包膜蛋白之外的所有HIV蛋白。其中删除了一部分包膜基因，并插入一个用于监测在抗病毒药存在或不存在的情况下病毒的复制能力的指示性基因序列，在本专利技术中是“萤火虫荧光素酶”基因序列。部分删除了3′U3区域，以阻止受感染细胞中5′LTR起始的转录。这一系统产生的病毒仅限于一轮复制。图1B.以细胞为基础的侵入分析法通过将pHIVenv和pHIVlucU3共转染宿主细胞，进行药物敏感性、辅助受体向性和病毒中和性试验。宿主细胞产生与来源于受试病毒或病人样本的包膜蛋白序列相仿的HIV病毒颗粒。转染后(约48h)收集病毒颗粒，用之感染表达HIV受体(如CD4)和辅助受体(如CXCR4、CCR5)的靶细胞。感染后(约72h)将靶细胞裂解，测定荧光素酶活性。为了成功感染目标宿主细胞并产生荧光素酶活性，HIV必须完成一轮复制。如果病毒不能够进入靶细胞，荧光素酶活性则较弱。该系统可以用于评价对侵入抑制剂的敏感性、受体和辅助受体向性及病毒中和性。图2.HIV包膜表达载体从病人样本中扩增HIV包膜序列，并利用限制性内切酶位点(5′a/b和3′c/d)将之插入表达载体。包膜的转录由人巨细胞病毒(CMV)的即早基因启动子驱动。包膜RNA通过猴病毒40(SV40)的腺苷酸化信号序列(A+)得以腺苷酸化。在CMV启动子HIV包膜序列之间设计有一个内含子，以增加受转染细胞中包膜mRNA的水平。FL-表达全长的包膜蛋白(gp120、gp41)；CT-表达缺失gp41中C-端胞质尾结构域的包膜蛋白(gp120、gp21)；+CT-表达包含恒定、未成熟gp41胞质尾结构域的包膜蛋白(gp120、gp41)；gp120-表达来源于病人的gp120蛋白和恒定、未成熟的gp41。gp41-表达恒定、未成熟的gp120和来源于病人的gp41。图3A.辅助受体向性筛选分析法在该图中，该分析法利用两种细胞系进行。一种细胞系表达CD4和CRR5(上面6组)。另一种细胞系表达CD4和CXCR4(下面6组)。使用从pHIVenv和pHIVlucU3载体转染的细胞中获得的大量重组病毒原种感染细胞，来进行这种分析。图中示例是对96孔板中形成的96种病毒的分析。感染在不存在药物(没有药物)或存在抑制R5向性病毒(CCR抑制剂)或X4向性病毒(CXCR4抑制剂)的药物的条件下进行。通过将药物存在或不存在条件下各种细胞产生的荧光素酶活性相比较，确定辅助受体向性(对分析结果的解释见图3B)。图3B.测定辅助受体向性在该图中，通过将各样本中的病毒对CD4/CCR5表达细胞(R5细胞)和CD4/CXCR4表达细胞(X4细胞)的感染能力(产生的荧光素酶活性)相比较，对分析结果加以解释。另外，还评价了CCR5或CXCR4抑制剂特异性阻断感染(抑制荧光素酶活性)的能力。X4向性病毒(绿色组)——感染X4细胞，但不感染R5细胞。CXCR4抑制剂能够阻断对X4细胞的感染。R5向性病毒(蓝色组)——感染R5细胞，但不感染X4细胞。CCR5抑制剂能够阻断对R5细胞的感染。具有双重向性的病毒或X4/R5向性病毒混合物(黄色组)——感染X4和R5细胞。CCR5抑制剂能够阻断对R5细胞的感染，CXCR4抑制剂能够阻断对X4细胞的感染。无生存力的病毒(红色组)——在X4和R5细胞中均不能复制。图4A.测定侵入抑制剂的敏感性融合抑制剂该图说明对融合抑制剂T-20的敏感性。在不存在T-20和存在不同浓度T-20(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4、CCR5和CXCR4的细胞。通过将T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性和无T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。对R5向性、X4向性和双重向性的病毒进行试验。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的T-20浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对T-20的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。NL4-3已鉴定的X4向性株；JRCSF已鉴定的R5向性株；91US005.11从NIH AIDS研究和参照药剂项目组(AIDS Research and ReferenceReagent Program本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，包括（ａ）从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；（ｂ）使用（ｉ）步骤（ａ）中的核酸，和（ｉｉ）缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体， 共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；（ｃ）在化合物存在的条件下，将步骤（ｂ）中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；（ｄ） 测定第二细胞产生的信号量，以测定病毒颗粒的感染性；并（ｅ）将步骤（ｄ）中测得的信号量和无化合物存在时产生的信号量相比较，其中化合物存在时测得信号量减少意味着化合物抑制病毒侵入第二细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CJ佩特罗普洛斯，NT帕金，J惠特科姆，W黄，
申请(专利权)人：瓦罗洛吉克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]