本发明专利技术涉及抗禽流感特异性ＩｇＹ的制备方法及其制剂，为解决现有抗禽流感产品耐药性和不能预防等问题，本发明专利技术中，先以多种方法制备禽流感抗原，再用制得的禽流感抗原对产蛋禽类进行注射免疫，制得抗禽流感免疫蛋，然后取其蛋黄制得抗禽流感特异性ＩｇＹ粗提物，再经纯化、过滤处理后，即制得抗禽流感特异性ＩｇＹ成品，具体可以是抗禽流感病毒特异性ＩｇＹ、抗禽流感病毒多肽ＨＡ↓［２］特异性ＩｇＹ、抗禽流感病毒受体特异性ＩｇＹ；还可制备抗继发感染致病菌特异性ＩｇＹ。将抗禽流感特异性ＩｇＹ与抗继发感染致病菌特异性ＩｇＹ按适当比例混合，可制得抗禽流感特异性复合ＩｇＹ。利用抗禽流感特异性ＩｇＹ或抗禽流感特异性复合ＩｇＹ，配以９９．９９－８０．０％的辅料，可制成各种具有治疗、预防禽流感双重功效的制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗禽流感特异性IgY及其新型制剂，属医疗卫生
技术介绍
禽流感是禽流行性感冒的简称(其英文为avian influenza，简称AI)，它是由甲型流感病毒(influenza A virus)引起的禽类感染病，主要发生在鸡、火鸡、珍珠鸟以及其它禽类，特别是迁徙类水禽如野鸭、天鹅等。近年来，禽流感在世界各地的侵袭日趋频繁，不但给这些国家的家禽养殖业带来沉重的打击，同时也严重威胁着人类的健康和生命。世界卫生组织已将禽流感列为A类动物疫病。鉴于禽流感的严重危害性，科学家们一直在探索如何去预防和治疗禽流感，特别着重在疫苗上的研究。但是，由于禽流感病毒和人流感病毒一样，其抗原性会不断漂移与变异，而禽流感疫苗的研制速度不可能跟上病毒的变异速度，因此实际效果很不理想。目前世界各国抢购的特敏福乐感清等药品对甲型流感有一定的治疗作用，在尚无专门针对禽流感的特效药的情况下，人们不得已先将其当成治疗禽流感的权宜选择。但是，该类药物对中枢神经系统有明显副作用，并且易出现耐药毒珠的传播，最近在印度尼西亚已出现了对特敏福耐药的禽流感病毒株；因而限制了其在临床上的应用。而且，这些药品都不可能用于预防禽流感。
技术实现思路
针对现有技术的上述缺陷，本专利技术要解决现有抗禽流感产品对中枢神经系统有明显副作用、易产生耐药性、预防效果不明显等问题，以提供一种抗禽流感病毒特异性IgY及其制剂。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种制备抗禽流感特异性IgY的方法，其中包括以下步骤(S1)制备禽流感抗原；(S2)利用所述禽流感抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗禽流感免疫蛋；(S3)取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黄，制备抗禽流感特异性IgY粗提物；(S4)对所述抗禽流感特异性IgY粗提物进行纯化，制得抗禽流感特异性IgY纯品；(S5)对所述抗禽流感特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗禽流感特异性IgY成品。本专利技术中，所述抗禽流感特异性IgY可为抗禽流感病毒特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒抗原选定有代表性、最常出现的禽流感病毒株，包括A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株；将所述H5N1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养，收取含有病毒的尿囊液，以鸡红细胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化，得到纯化的四种禽流感病毒；分别取所述纯化的四种禽流感病毒，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，分别制得H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种禽流感病毒裂解液；取所述四种禽流感病毒裂解液中的至少两种，制成混合裂解液，再按1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆器中以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种禽流感病毒裂解成份的病毒复合抗原为制备抗禽流感病毒特异性IgY，在本专利技术的所述步骤(S1)中，还可按以下步骤制备制备禽流感疫苗抗原取现在的禽流感疫苗，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，制得禽流感病毒裂解液；按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感复合抗原。本专利技术中，所述抗禽流感特异性IgY还可为抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒多肽HA2抗原用RT-PCR方法从甲型禽流感RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信号肽和穿膜区的片段；先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株；挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜；稀释后继续培养，待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时；于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量，选表达量最高的时间收获，离心去除细胞沉淀，上清中即含大量表达产物；经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即获得纯化的禽流感HA2抗原；以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得含禽流感HA2表达蛋白的抗原。本专利技术中，所述抗禽流感特异性IgY还可为抗禽流感病毒受体特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒受体抗原取流感病毒受体，将其中的「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」表达蛋白按1∶1比例混合，制成浓度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。其中，所述流感病毒受体是通过以下步骤制得的用RT-PCR方法分别从流感病毒受体，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信号肽和穿膜区的片段；先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株，挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜；稀释后继续培养，待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时；于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中受体蛋白的表达量，选表达量最高的时间收获，离心去除细胞沉淀，上清中即含大量表达产物；经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即分别获得纯化的流感病毒受体---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」的抗原成分。本专利技术还提供一种制备抗继发感染致病菌特异性IgY的方法，其中包括以下步骤(S21)按以下步骤制备继发感染致病菌抗原将A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、MRSA金黄色葡萄球菌、以及肺结核菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，制得致病细菌混合物，再将这种致病细菌混合物按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000-30,000rpm处理，成为油包水乳液，即制得继发感染致病菌复合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备抗禽流感特异性ＩｇＹ的方法，其特征在于，包括以下步骤： （Ｓ１）制备禽流感抗原； （Ｓ２）利用所述禽流感抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗禽流感免疫蛋； （Ｓ３）取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黄，制备抗禽流感特异性ＩｇＹ粗提物； （Ｓ４）对所述抗禽流感特异性ＩｇＹ粗提物进行纯化，制得抗禽流感特异性ＩｇＹ纯品； （Ｓ５）对所述抗禽流感特异性ＩｇＹ纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗禽流感特异性ＩｇＹ成品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：包晟，杨荣鉴，王长安，蔡婷英，包海威，
申请(专利权)人：雅臣药业集团远东有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]
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