抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY的制备方法及其组合制剂技术

本发明专利技术涉及抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合鸡蛋黄免疫球蛋白（简称抗ＣＶＭＤ－ＩｇＹ）的制备方法及其组合制剂，为解决因柯萨奇病毒引起的心肌炎尚没有特效治疗药物的问题，本发明专利技术中过下列步骤制备抗ＣＶＭＤ－ＩｇＹ：（１）在细胞中扩增柯萨奇病毒１－５型，并纯化，灭活，制备抗原；（２）用所述柯萨奇病毒抗原免疫家禽，得到免疫蛋；（３）从所述免疫蛋中提取抗ＣＶＭＤ－ＩｇＹ粗提物；（４）对所述ＩｇＹ粗提物进行纯化，得到抗ＣＶＭＤ－ＩｇＹ纯品。本发明专利技术还提供由上述抗ＣＶＭＤ－ＩｇＹ所制成的多种组合制剂，例如喷雾剂、肠溶片、注射剂等，用于预防和治疗病毒性心肌炎，具有特效、安全、使用方便的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于预防和治疗萨奇病病毒性心肌炎的药物，更具体地说，涉及一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY(鸡蛋黄免疫球蛋白)的制备方法及其组合制剂。
技术介绍
1899年，Fiedler(菲德勒)首次报道了因发热、呼吸困难、抽搐、昏迷死亡的3例病毒性心肌炎临床病例。在此后的一百多年间，随着医学微生物学和有关科学技术的发展，对该病的病因、发病机理及免疫等研究有了很大的突破，但治疗方面仍无大进展。20世纪70年代后，病毒性心肌炎发病日趋增多，特别是在儿童中不但发病率高，而且后果严重，1/3的患者不能完全恢复正常的心脏功能，1/3发展为慢性心肌炎和心脏功能紊乱，1/3最终进展为慢性心脏功能衰竭而死亡或需要心脏移植。根据国内外的流行病学调查资料，人群中病毒性心肌炎的患病率为2.3-5％。病毒流行期间感染人群的发病率达12-33％，婴儿中发病率可达50％。我国湖北、云南等地曾发生病毒性心肌炎的爆发流行，期间当地发病率达26.8-50％，病死率高达23.6％。对医学界来说，病毒性心肌炎的诊断和治疗是其面临的严重挑战。很多病毒可以引起心肌炎，迄今已明确的有十余种病毒，但肠道病毒和腺病毒最常见。特别肠道病毒中的柯萨奇B组病毒(以下简称CVB)，在急慢性病毒性心肌炎患者中约有50％以上可以检测到其IgM和中和抗体。在病毒性心肌炎的活检和尸检组织中，有相当多的标本可以检查到CVB的抗原和核酸。此外用CVB病毒感染小鼠，可使其心肌产生类似人病毒性心肌炎样的病理变化。总而言之，目前普遍认为CVB是引起病毒性心肌炎的最主要病毒。CVB分6型，其中1-5型均可引起心肌病变。另外，腺病毒、柯萨奇A组病毒、ECHO病毒、疱疹病毒等也可引起病毒性心肌炎。通过对病毒性心肌炎动物模型的研究，该病的发病机理已基本明确。病毒的直接作用和机体的免疫反应是主要机制。在急性和亚急性期，大量病毒在心脏组织中复制、增殖和播散，直接造成心肌细胞的溶解和坏死。随后，巨噬细胞、NK细胞和T细胞先后浸润心肌，其介导的细胞毒作用在溶解病毒感染心肌细胞，杀灭病毒同时，也损伤了心肌细胞，特别是在T细胞免疫被IL-2等炎症因子过度激活和心脏反应性自身抗体产生的情况下，损伤更为严重。在慢性期，主要表现为病毒在心肌细胞中长期的低水平的复制，可直接损伤心肌结构和功能，也可持续激活免疫反应和自身免疫反应而致心肌间接损伤，最终导致扩张性心肌病。因此，病毒性心肌炎的治疗在急性期以抗病毒为主，而在急性后期和慢性期抑制过度的炎症反应和自身免疫反应更为重要。目前对病毒性心肌炎的治疗仍无特效的方法。临床以减轻心脏负担、抗心律失常和免疫调节等对症治疗为主。近年来有报道用人免疫球蛋白治疗由CVB和EMV(小鼠脑心肌炎病毒)引起的小鼠病毒性心肌炎，取得了很好的疗效。不管免疫球蛋白与病毒同时接种小鼠，还是在病毒感染2周后使用，心肌细胞的坏死和炎症细胞的浸润均明显减少；炎症相关的细胞因子下降；小鼠的生存时间明显延长。特别是前者免疫球蛋白几乎完全抑制了病毒对心肌的损害，在实验过程中没有小鼠死亡。对于免疫球蛋白治疗病毒性和自身免疫性疾病的机理并不十分清楚，目前认为与以下几点有关(1)免疫球蛋白中存在有一定的中和抗体；(2)大量抗体通过注射进入机体后，使保护IgG免受分解代谢的Fc受体饱和，从而促进自身抗体的分解；(3)免疫球蛋白在血浆中象各补体成分污水池，减少了血中的补体，减轻炎症反应；(4)抑制了炎症有关的细胞因子的释放，减少了T细胞的增殖和浸润。用人类高效免疫血清和免疫球蛋白来防治病毒性疾病，近现代一直在使用，特别是对一些病毒的紧急预防如HBV，目前最有效仍是高效价的人抗HBV免疫球蛋白。在抗SARS(非典型肺炎)感染中，解放军总院姜素春教授用康复者血清成功治疗了自身SARS感染，是近期引人注目的例子。但是这些治疗方法存在种种限制和潜在不安全因素。首先人类高效免疫血清和免疫球蛋白来源困难，只有在人群感染较多情况下才有足够的血清可供选择。其次血制品安全一直是一个没有解决的问题。而且由于哺乳动物的抗体IgG能激活人类的补体系统，且会与血清、类风湿因子反应，干扰人体IgG，造成交叉免疫学反应，因此在很多方面限制了其应用。鉴于以上种种原因，本专利技术申请人在这方面做了开创性的研究，发现雌性禽类对人类各种抗原有非常良好的免疫应答性，以少量抗原免疫即可产生大量持久性IgG，再从血清传至卵黄，经分离提取纯化可得到大量卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，以下简称IgY)。由于禽类在系统发生上与哺乳类相差甚远，因此IgY不会与哺乳类发生血清交叉反应和类风湿因子结合，也不会激活人体补体系统，不会干扰人类IgG，完全避免了抗生素和化学合成药物的毒副作用和耐药菌产生。而且生产、提取、分离完全对环境无污染。防治过程中，只对病原体进行损伤，对人类有益菌无任何作用，从而维护了局部微生态平衡。特异性IgY已在抗龋齿，抵抗幽门螺杆菌、沙门菌和轮状病毒感染的实验研究取得了成功。IgY属IgG--类免疫球蛋白，具有中和抗体的作用，它能与相应抗原发生特异性结合，从而改变其相应的抗原表面，如病毒表面的构型，阻止病毒吸附于易感细胞；另外，IgY与其相应的病毒结合后，可形成免疫复合物，易被巨噬细胞所吞噬掉。申请人在IgY的分离、提取、纯化方面有自己独有的专利核心技术(JasonMedical Holdings Inc.USA)，并在全球首次将特异性复合IgY制备的漱口液和口腔喷雾剂试用于人体防治疾病和预防保健。申请人一直从事柯萨奇病毒性心肌炎的治疗和预防的研究工作。对柯萨奇病毒的DNA疫苗和口服基因疫苗进行了研究，发现这两种疫苗均能刺激机体产生一定的免疫反应，对同型的病毒感染有一定的保护能力，但体液免疫的抗体滴度低，特异性细胞也不够强大，特别是对其他型别的柯萨奇病毒和肠道病毒没有有效的交叉保护作用，这些限制了其运用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中用于防治心肌炎的药物比较单一且效果不太理想的问题，以开拓柯萨奇病毒性心肌炎防治研究的新途径。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY(以下简称抗CVMD-IgY)的制备方法，其中包括下列步骤(1)制备引起柯萨奇病毒性心肌炎的抗原；(2)用所述抗原免疫家禽，并检取所述家禽所产的免疫蛋；(3)从所述免疫蛋中提取抗CVMD-IgY粗提物；(4)对所述IgY粗提物进行纯化，得到抗CVMD-IgY纯品。在本专利技术所述方法的第(1)步中，可通过以下步骤制备CVB1-5型抗原病毒的培养，取Hela细胞分别培养柯萨奇B组1-5(CVB1-5)型病毒；病毒的纯化，采用终末稀释传代方法，最末稀释度出现CPE的管作为纯化的毒株；采用福尔马林进行灭活处理；最后与福氏佐剂混合，制备成CVB1-5型抗原。在本专利技术所述方法的第(2)步中，可按以下具体步骤制备免疫蛋用所述CVB1-5型抗原对产蛋禽类进行注射免疫，每隔二周再强化注射一次，共计免疫三次；在第一次免疫20天后，检取免疫后的禽类所产免疫蛋。在本专利技术所述方法的第(2)步中，还包括以下优选具有高免疫应答能力的良种产蛋禽类的步骤用所述CVB1-5型抗原分别免疫多只产蛋禽类，每次注射1ml抗原，在第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合ＩｇＹ的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：（１）制备引起柯萨奇病毒性心肌炎的抗原；（２）用所述抗原免疫家禽，并检取所述家禽所产的免疫蛋；（３）从所述免疫蛋中提取抗柯萨奇病毒性心肌 炎的特异性复合ＩｇＹ粗提物；（４）对所述ＩｇＹ粗提物进行纯化，得到抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合ＩｇＹ纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨荣鑑，陈洪，刘晶星，包晟，胡国柱，聂荣庆，李同森，蔡婷英，
申请(专利权)人：雅臣药业集团远东有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]