【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY及其制备方法，特别是涉及用于预防和治疗非典型肺炎的多种组合的复合IgY及其制备方法和组合制剂。 目前世界上治疗非典型肺炎(SARS)的方法主要是使用抗病毒药物[如Ribavirin(三氮唑核苷)等]和糖皮质激素以及抗生素或中草药。目前，全世界尚无真正对病毒有确切疗效的化学药物，而且普遍存在严重的副作用。加拿大卫生部根据加拿大与美国疾病控制及预防中心专家的临床经验，以及Ribavirin(三氮唑核苷)对引发疾病的冠状病毒无效的测试，加上不少严重的药物反应报告，已于2003年5月1日宣布停止使用Ribavirin(三氮唑核苷)。使用糖皮质激素会使人体的免疫系统受损，大剂量使用糖皮质激素往往是导致病人最后对药物毫无反应，最后无药可救而死亡的主要原因。中草药对非典型肺炎(SARS)只有调理作用，很难有确切有效的治疗效果。 IgY(Immunoglobulin of Yoik)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。 由于IgY能够特异性与病原体结合并将其有效抑制，就可以克服抗病毒化学药物对病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又十分明显的致命缺点，从而达到有的放矢地从发病根源上预防和治疗由变异的冠状病毒这种病原体引发的非典型肺炎(SARS)的目的。
技术实现思路
本专利...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法包括下列步骤优选引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，制备非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制备免疫蛋；制备抗非典型肺炎(SARS)各种致病病毒特异性IgY粗提物；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物的纯化；制备抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY。2.如权利要求1所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法包括下列步骤筛选引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，在筛选和分类组合各种致病病毒的基础上，分别制备单一或复合的非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原将Vero E6细胞接种于FCSDMEM培养液中，将上述培养液置于培养瓶中，将此培养瓶放置在培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将各组别的SARS致病病毒毒株分别用FCS和青链霉素DMEM培养液稀释，取稀释液加入细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶放置在培养箱中培养至细胞病变达++++时收获病毒，放入高速离心机中高速离心分离，收集上清，再灭活所培养的SARS致病病毒，将培养好的各组别的病毒单独或按适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例分别加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成单一或复合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制备免疫蛋用各种单一或复合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原或非典型肺炎(SARS)继发感染细菌抗原，分别对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，一个月计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的禽类所产免疫蛋，并对相应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；制备抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品，最后，将所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物的纯化将以上工艺所制取的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物分别先后过离子交换柱和凝胶层析柱，即得纯IgY；3.如权利要求1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中引致非典型肺炎(SARS)的致病病毒是冠状病毒。4.如权利要求3所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该冠状病毒是一种变种的冠状病毒，包括它的多种变异型，有香港传播的香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒，北京传播的多种型冠状病毒，加拿大型冠状病毒，新加坡传播的冠状病毒，越南传播的冠状病毒。5.如权利要求1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中制备免疫蛋所采用的产蛋禽类包括母鸡，母鸭，母鹅、火鸡、鸵鸟。6.如权利要求2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中所述非典型肺炎(SARS)一种或多种致病病毒抗原的制备是这样的首先按权利要求2所述的方法培养优选的一种或多种病毒，选择一种致病病毒时，直接加入福氏佐剂制作单一抗原；选择多种致病病毒时，则先将培养好的一种以上SARS致病病毒按1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此类推的比例均匀混合，然后加入福氏佐剂制成复合抗原。7.如权利要求1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY可以制成临床可接受的剂型。8.抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒多种致病病毒特异性IgY，其特征在于这种抗多种致病病毒特异性IgY的制备方法包括下列步骤分别用香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，然后，将培养好的灭活的香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制得含四种冠状病毒抗原的复合抗原；用制得的冠状病毒复合抗原对产蛋母鸡进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取母鸡所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒和抗香港4型冠状病毒特异性复合IgY粗提物干粉，将以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，先后经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒和抗香港4型冠状病毒特异性复合纯IgY。9.一种抗北京型冠状病毒特异性IgY，其特征在于这种抗一种致病病毒的特异性IgY的制备方法包括下列步骤用北京型冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将北京传播的有代表性的冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制得匀质抗原；用所制得的北京型冠状病毒抗原对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取禽类所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得抗北京型冠状病毒特异性IgY粗提物干粉，将以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗北京型冠状病毒特异性纯IgY。10.一种抗加拿大型冠状病毒特异性IgY，其特征在于该抗加拿大型冠状病毒特异性IgY的制备方法包括下列步骤用收集到的加拿大地区传播的有代表性的非典型肺炎(SARS)致病冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将加拿大传播的有代表性的冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌即制成油包水溶液状致病病毒抗原；用制得的病毒抗原对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取禽类所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，即得抗加拿大型冠状病毒特异性IgY粗提物；将以上IgY粗提物经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得到抗加拿大型冠状病毒特异性纯IgY。11.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY制剂，其特征在于该特异性IgY制剂的制备方法包括下列步骤将用以上方法制备的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01％以上的溶剂，制成一种新型雾化剂，加入各种雾化器中，经过雾化后供非典型肺炎患者吸入呼吸道和肺部。12.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性鸭IgY，其特征在于该特异性鸭IgY的制备方法包括下列步骤选具高免疫应答能力的良种鸭用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鸭，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸭所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸭200只，再用这批鸭所产的蛋孵出优良鸭种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭，并挑选其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原的制备将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5...
【专利技术属性】
技术研发人员：包晟，
申请(专利权)人：雅臣药业集团远东有限公司，
类型：发明
国别省市：
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