抗SARS冠状病毒的基因疫苗及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗ＳＡＲＳ冠状病毒的基因疫苗及应用，含有ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段的真核表达质粒；编码ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的核苷酸序列可操作地连接于一个启动子序列后，以便体内表达所编码的ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的完整或部分多肽。将所述基因疫苗用于包括人类和啮齿类动物如小鼠在内的宿主进行免疫，使其产生特异性保护性的体液免疫和细胞免疫，以抵抗引起非典型性肺炎传染病的ＳＡＲＳ冠状病毒的感染。本发明专利技术稳定性好，生产方便，价格便宜，能诱导机体同时产生针对引起非典传染病的ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫，为治疗和预防非典型性肺炎提供了有效且价廉的疫苗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及预防和治疗由SARS冠状病毒引起的非典型性肺炎疫苗的领域，尤其涉及编码SARS冠状病毒S蛋白的核酸序列的疫苗。还涉及该疫苗在抗SARS冠状病毒中的用途。
技术介绍
称为非典型肺炎的严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Sydrome，SARS)已经在全世界20多个国家和地区发生。据世界卫生组织统计，截至5月22日日内瓦时间17:00，来源全球累计报告病例8046，死亡病例682；全国内地累计报告非典型肺炎病例5285例，死亡303例。这场突如其来的灾难给全世界人民特别是中国人民带来了巨大的人员上和经济上的损失。到5月22日为止，仅有改善症状的化学药物，如“西维来司钠”，用于改善全身性炎症反应综合症及特发性肺纤维化等引发的急性肺损伤，和提高机体免疫机能，如糖皮质激素，以及广谱抗病毒药物“基因工程人ω干扰素”，未见有特异性治疗和预防由SARS冠状病毒引起的非典型性肺炎的药物上市。这使得发展一种预防和治疗由SARS冠状病毒引起的非典型性肺炎的疫苗显得十分紧急和重要。在疫苗的研制上，存在着三种选择。第一种方式是采用减毒或灭活的SARS冠状病毒制成的非典型性肺炎疫苗，它是将SARS冠状病毒通过物理或化学的方法减低或消除其感染性，然后直接作为疫苗使用。其仍然有毒力回复的潜在可能性，具有非常大的危险性。第二种方式是采用基因工程蛋白质或多肽作为疫苗，是将SARS冠状病毒的部分抗原基因在酵母、大肠杆菌等细胞内表达，得到的蛋白质经过纯化作为疫苗。但是由于表达得到的蛋白往往不能得到正确的翻译后加工，使用该蛋白制成的疫苗的抗原性往往较差，不能使机体产生良好的保护性免疫反应；另外此种疫苗的主要成分是蛋白质，十分不稳定，需要在销售和运输中始终保持“冷链运输”，这大大增加了其生产成本，而且使该种疫苗有效率大大降低。而基因疫苗，是近几年发展起来的第三代疫苗。它是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组的载体基因直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗体激活机体的免疫系统，引发免疫应答。大量的实验结果表明，基因疫苗不仅可用于人类疾病，而且还可以广泛应用于人畜共患病和动植物疾病。基因疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。与基因工程蛋白疫苗只能诱导机体产生体液免疫相比，基因疫苗能同时诱导机体产生强大的体液免疫和细胞免疫，这在诱导机体产生对抗病原体感染特别是病毒性感染中，具有很大的优势和应用前景—体液免疫所产生的抗体能中和血液和组织液中的病毒颗粒；而细胞免疫能使各类杀伤细胞识别并杀死被感染的宿主细胞，在病毒颗粒成熟之前就将其寄生的宿主细胞杀死，使得病毒无法扩增，释放，入侵未感染的宿主细胞，从而达到治疗的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗SARS冠状病毒的基因疫苗，该疫苗稳定，在常温下保存，能够方便地运输，储存，可同时引起人体针对SARS冠状病毒体液免疫和细胞免疫。本专利技术的另一个目的在于提供一种抗SARS冠状病毒的基因疫苗在预防和治疗非典型性肺炎中的应用。本专利技术涉及多核苷酸，包括DNA，进行免疫，使机体抵抗由SARS冠状病毒所引起的非典型性肺炎，涉及含有用于所述目的的基因疫苗中的SARS冠状病毒S蛋白的全长基因或其片段。本专利技术中，构建了若干重组质粒，以便包括编码SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列。本专利技术提供的技术方案实施步骤为a.采用基因合成的方法或通过RT-PCR从病人血清中扩增的方法得到SARS冠状病毒S蛋白部分或全长基因片段。b.将a步骤所得到的基因片段插入到带有人类立即早期巨细胞病毒(CMV)的启动子，或其它类似真核表达启动子的商品化的真核表达载体中。c.将所得到的带有a步骤所得到的基因片段的重组真核表达载体，使用限制性内切酶酶切方法或PCR方法经过鉴定。d.在大肠杆菌中扩增c步得到的重组真核表达载体，去除其中的杂质，如宿主细菌染色体DNA，RNA和蛋白质。e.将d步所得到的纯化的重组真核表达载体加入到合适的制剂中，如生理盐水，调节重组真核表达载体的浓度到合适的免疫用浓度，范围为0-100mg/ml，即得到可用于本专利技术目的抗SARS冠状病毒的基因疫苗。编码SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列见序列表，本专利技术所涉及的SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列包括表1所示的完整序列和其片段。编码SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列可操作地连接于一个启动子序列后，以便体内表达所编码的SARS冠状病毒S蛋白的完整或部分多肽。所述启动子序列可以是人类立即早期巨细胞病毒(CMV)的启动子，也可以使用任何其它常见启动子，包括组成型启动子，如肉瘤病毒LTRs，和诱发型启动子，如金属硫蛋白启动子和组织特异性启动子。运用本专利技术提供的技术方案得到含SARS冠状病毒S蛋白部分或全长基因序列的基因疫苗。其中含SARS冠状病毒S蛋白全长基因序列的基因疫苗，即重组质粒pCDNA-S保存于大肠杆菌Escherichia coli DH5 α-pCDNA-S中，CCTCC NoM203044。上述重组真核表达质粒含有若干基本骨架单位原核复制起始点fi origin和pPUCorigin；真核复制起始点SV40；新霉素抗性基因；氨卞青霉素抗性基因；以及若干个具有免疫佐剂功能的非编码免疫刺激序列(ISS)。本专利技术与采用减毒和灭活疫苗制成的非典型性肺炎疫苗和基因工程蛋白质或多肽制成的非典型性肺炎疫苗疫苗相比，含SARS冠状病毒S蛋白基因片段的基因疫苗具有以下优点使其在预防和治疗由SARS冠状病毒引起的非典型性肺炎传染病中具有很大的优势(1)可同时引起人体针对SARS冠状病毒的体液免疫和细胞免疫。(2)制备简便，省时省力。外源抗原基因很容易克隆进表达载体，数天内可以扩增并纯化。(3)比较安全。含SARS冠状病毒S蛋白基因片段的基因疫苗接种后，在哺乳动物细胞内，能高水平表达病毒抗原基因，不涉及感染性因子，不依赖病毒颗粒的装配，避免了采用活病毒疫苗的危险。(4)可提供对多种病毒株的广谱有效的疫苗。由于载体本身不诱导免疫应答，因此可组建含有多种抗原DNA的基因疫苗联合接种免疫。(5)含SARS冠状病毒S蛋白基因片段的基因疫苗接种后，由于表达抗原蛋白的时间为1-2月，能强化B细胞和T细胞的记忆，引起持久的体液和细胞免疫应答。(6)含SARS冠状病毒S蛋白基因片段的基因疫苗较稳定，可以在常温下保存，能够方便的运输、储存。(7)价格便宜。通过同源对比表明，SARS冠状病毒S蛋白是介导SARS冠状病毒识别宿主细胞以及入侵过程中的膜融合过程的关键蛋白，与SARS冠状病毒入侵人体的致病过程密切相关。SARS冠状病毒S蛋白位于病毒囊膜表面，在病毒入侵时介导病毒与宿主细胞膜表面受体的相互作用，并留在细胞表面，成为受病毒感染细胞的表面标志，从而成为抗体与淋巴细胞的攻击的标靶，因而可以用作非典型性肺炎预防与治疗的重要基因。运用生物信息学手段对SARS冠状病毒S蛋白基因片段的抗原性进行分析，结果表明其具有A，B，C三个抗原性评价值非常高的区域，其中B，C区位于SARS冠状病毒S蛋白S2亚基的位于病毒外部的羧酸端多肽肽段中，长度分别为130aa，其抗原性非常强，分别具有4个以上MHCII分子结合位点，是具有强抗原性的疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＳＡＲＳ冠状病毒的基因疫苗，其特征在于含有ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段的真核表达质粒；编码ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的核苷酸序列可操作地连接于一个启动子序列后，以便体内表达所编码的ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的完整或部分多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶凯，丁虹，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]