本发明专利技术涉及一种可用于冠状病毒防治的病毒加帽系统多肽抑制剂，及利用该多肽抑制剂抑制冠状病毒加帽系统活性的方法。该多肽抑制剂包括下述氨基酸序列的多肽：1）SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或，2）SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQIDNo.1所示序列衍生的序列；或3）SEQIDNo.1所示序列的截短序列，该截短序列至少包括GGASCCLYCRCH。该抑制剂具有极高的特异性，克服了传统病毒加帽系统抑制剂专一性低的不足，同时作为冠状病毒防治的先导药物，其克服了目前非特异性治疗药物副作用大，容易导致后遗症的缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、病毒学、生物化学、蛋白(酶)结构功能研究和生物医药
特别是涉及一种可用于抑制SARS-CoV等冠状病毒的加帽修饰功能及其复制转录的多肽抑制剂。
技术介绍
冠状病毒(COTonavirus)是一类感染人、家禽、家畜，进而引起呼吸道、消化道炎症、腹泻的致病RNA病毒。其中由SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染引起的严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndromes,简称SARS),是一种新的呼吸道传染病，以发热、干咳、胸闷为主要症状，严重者出现快速进展的呼吸系统衰竭，传染性极强、病情进展快速(Ziebuhr，2003)。2003年，该病毒世界范围爆发时，致死率达到10%，尤其在成年人中更是高达50%，造成了严重的社会恐慌和经济损失。目前仍无有效的疫苗和特异性治疗方法，且冠状病毒的广泛存在和高重组率易发生新发野生型病毒，因而是全世界面临的主要健康威胁之一。目前针对SARS冠状病毒的治疗方法，主要分为三类1.免疫调节因子，如干扰素，利巴韦林等；2.阻止病毒入侵细胞分子，如S蛋白的单克隆抗体，针对S蛋白关键融合区域的多肽等；3.抑制病毒复制分子，如病毒聚合酶特异性抑制剂，广谱性蛋白酶抑制剂等。这些方法中，免疫调节因子和广谱性蛋白酶抑制剂均是非特异性治疗方法，副作用较大，治愈的病人容易留下后遗症，且治疗效果存在较大的个体差异性(Groneberg etal. , 2005; Tong, 2009)。病毒RNA 5’末端的帽子结构具有稳定病毒RNA，指导RNA定位，起始病毒蛋白翻译，逃逸免疫识别等重要功能，是病毒复制转录所必须的(Banerjee, 1980;Daffis etal.，2010;Furuichi and Shatkin, 2000;Lewis and Izaurralde, 1997;Muthukrishnanet al. , 1975;Schwer et al.，1998;Shatkin，1976;Shimotohno et al. ,1977;Zust etal. , 2011) o因此，如何有效抑制病毒加帽系统，成为开发抗病毒药物的一个新领域(Donget al.，2008; Shuman, 2001; Shuman, 2002)，目前已经有一些广谱的抑制病毒加帽系统的药物，如AdoHcy、Sinfungin、ATA等(Bouvet et al.，2010)。但是这些非特异性的抑制药物容易对宿主本身的加帽系统造成影响，有较大的副作用，还未能进入实际使用阶段。SARS冠状病毒的基础研究目前取得了一定的进展，对复制和转录的机制有了一定的了解，并且对各蛋白的结构和功能也有一些深入的研究，其中对冠状病毒RNA基因组5’末端帽子结构的合成研究取得了突变性的进展。最近研究发现，SARS冠状病毒非结构蛋白nspl6在与病毒另一个非结构蛋白nsplO相互作用之后，具有2’ -0-甲基转移酶(2’ -O-MTase)活性，参与SARS冠状病毒RNA 5’末端Cap-I型帽子合成(Bouvet et al. , 2010;Lugari et al. , 2010;Pan et al.，2008)，而 SARS 冠状病毒单独的非结构蛋白nspl6几乎检测不到活性，只有猫冠状病毒(FCoV)非结构蛋白nspl6能检测到极低的2，-0_MTase活性(Decroly et al.，2008)。冠状病毒非结构蛋白nsplO作为nspl6的刺激因子，本身不具有2’ -O-MTase功能，但nsplO能够结合核酸并且参与RNA的复制和转录，发挥重要的调节功能(Donaldson et al. , 2007a;Donaldson et al. , 2007b;Matthes etal.，2006),且 nsplO 结构已经得到解析(Joseph et al. , 2006; Su et al.，2006)。由于SARS-CoV的两个非结构蛋白nspl6与nsplO相互作用之后，才具有2’-0-MTase活性，因此是一个很好的潜在药物靶点。然而到目前为止，还没有关于该作用靶点的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种高效的可用于冠状病毒防治的病毒加帽系统多肽抑制剂。为了实现上述目的，本专利技术以SARS冠状病毒非结构蛋白nsplO和nspl6复合物晶体结构(图I)为设计基础，用合成多肽竞争结合SARS冠状病毒非结构蛋白nspl6，阻止nsplO与nspl6的结合,从而抑制SARS冠状病毒nspl6甲基转移酶(2’_0_MTase)的活性， 阻止SARS冠状病毒RNA被加工成Cap-I型帽子。结果表明，在所设计的系列多肽中，SEQ IDNo. I所示的序列(K29)及其截短序列SEQ ID No. 2(K12)具有阻止nsplO与nspl6结合的作用，并呈现抑制SARS冠状病毒nspl6甲基转移酶(2’-0-MTase)活性的作用，最终抑制冠状病毒的复制。本领域技术人员可以根据上述方法设计出基于SEQ ID No. I的修饰物或类似物，用以阻止nsplO与nspl6结合的作用。例如，可将SEQ ID No. I所示序列的末位氨基酸缺失，或者是将第26位的Lys替换为Arg。据此，本专利技术首先提供一种多肽，其氨基酸序列为1) SEQ ID No. I所示的氨基酸序列；或，2) SEQ ID No. I所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQ ID No. I所不序列衍生的序列；S3)SEQ ID No. I所不序列的截短序列，该截短序列至少包括GGASCCLYCRCH。优选所述截短序列为GGASCCLYCRCH。本专利技术还提供一种用于抑制冠状病毒的多肽抑制剂，其包括上述的多肽。本专利技术还提供一种冠状病毒抗病毒药物，其包括上述的多肽。上述多肽可以通过人工直接合成，或者通过基因工程的手段体外表达获得。因此本专利技术还提供编码上述多肽的基因，含有所述基因的表达载体，以及含有所述表达载体的宿主细胞。所述的多肽、基因、表达载体或者宿主细胞，均可以直接或间接制备抗冠状病毒药物。因此，本专利技术还包括它们在制备抗冠状病毒中的应用。本专利技术还提供一种抑制冠状病毒加帽修饰或复制转录的方法，包括使用所述的多肽抑制nsplO与nspl6的结合。本专利技术提供多肽抑制剂，通过多肽抑制病毒两个非结构蛋白之间的相互作用来抑制冠状病毒加帽系统的活性，而对宿主本身不产生影响和副作用，使得该多肽抑制具有很高的特异性和应用前景。附图说明图I显示nsplO和nspl6复合物共结晶的晶体结构。(A)nspl6_nspl0复合体晶体结构。其中nsplO为绿色(箭头所示区域)，nspl6为淡蓝色(箭头所示以外区域)，两者均以飘带模式显示。(B)nsplO以飘带模式显示，nspl6以表面电荷模式显示。(C)nsplO和nspl6均以表面电荷模式显示。I-表面正电荷区，2-表面负电荷区。图2显示nsplO全长及不同截短突变体与nspl6发生相互作用的结果。NsplO全长共有139个氨基酸。“ + ”表示有相互作用，表示没有相互作用。图3显示nsplO全长及不同截短突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种多肽，其氨基酸序列为=DSEQ ID No. I所示的氨基酸序列;或，2)SEQ ID No. I所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQID No. I所示序列衍生的序列；*3)SEQ ID No. I所示序列的截短序列，该截短序列至少包括 GGASCCLYCRCH。2.根据权利要求I所述的多肽，其特征在于，其中所述3)中的截短序列为GGASCCLYCRCHο3.一种用于抑制冠状病毒的多肽抑制剂，其包括权利要求I或2所述的多肽。4.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭德银，陈宇，柯敏，吴安东，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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