一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法。本发明专利技术通过构建携带人NTCP基因的微环载体，采取水动力转染的转基因方式将其导入小鼠体内，使人NTCP基因在小鼠肝脏表达。这一模型将克服现有实验小鼠不能自然感染HBV的缺陷，建成一种具有乙肝病毒功能性受体，能够支持HBV体内感染且具有正常免疫功能的小鼠模型。从而可以真实、全面地反映临床乙肝发生、发展及慢性化过程，为进一步研究HBV的致病机制，HBV感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物模型制备
，具体涉及一种表达乙肝病毒受体--人NTCP 的小鼠模型的构建方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV)感染是全球范围内影响人类健康的重 大问题。由HBV感染导致的慢性进行性肝脏炎症病变，常常发展为肝硬化、肝癌并最终导致 死亡。据世界卫生组织报道，全球约20亿人已感染过HBV，目前约有3. 5亿人为HBV慢性感 染者，这些人进展为肝硬化、肝衰竭或肝癌的风险非常高。全球范围内30%的肝硬化和超过 50%的肝癌是由于HBV感染造成的，每年因 HBV感染造成的死亡人数约为100万-200万。 HBV感染引起的肝脏疾病仍然是一个亟待解决的重大公共卫生问题。一直以来，我国都是 HBV感染的高发区，乙肝发病率整体呈上升趋势，且以慢性HBV感染为主。资料表明：我国 现有的慢性HBV感染者约为9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，占慢性HBV感 染者的1/5强。广东一直是病毒性肝炎的高发地区，传染病疫情监测信息显示：广东省乙肝 表面抗原携带率为11. 10%，属于乙肝高流行区，尤其以成年人慢性乙型肝炎感染为主。由 此可见，我国乙型肝炎尤其是慢性乙型肝炎的防治任务仍然十分艰巨。 慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于携带有大量的HBV，是HBV的最主要传 染源。我国每年都投入大量的经费和人力物质资源用于该类人群的治疗和阻止HBV在人群 中的进一步传播。然而，目前仍缺乏有效的治疗慢性HBV感染的手段。一个重要的原因是 HBV慢性感染的机制至今未能明确。而长期以来缺乏合适的动物模型，严重阻碍了 HBV的 研宄进展。 人类HBV属于嗜肝DNA病毒科，有较强的种属特异性，因此建立起能广泛应用的 动物模型并非易事。HBV自然条件下只感染人、非人灵长类（如黑猩猩等）及树駒。黑猩猩 模型因其体积较大、成本高以及受伦理道德约束等限制了其应用；而树駒模型则由于其感 染效率低，仅能导致短暂的轻度感染，病毒滴度很低，而难以推广应用。研宄者也曾建立了 HBV相关的其它嗜肝DNA病毒的小动物模型来进行相关研宄，如鸭乙型肝炎模型，土拨鼠肝 炎模型，地松鼠肝炎模型等，但这些模型在药代动力学和免疫学遗传背景上与人类有很大 的不同，因此都无法成为人HBV相关研宄的理想模型。 近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研宄人员的关 注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研宄人员亦建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型， 基因转染HBV小鼠模型及HBV转基因小鼠模型等。但是，由于HBV感染人体后在体内不断 地复制，循环感染肝脏细胞，并由此引起机体的一系列免疫反应，或逃避免疫系统的监测和 清除，从而在体内长期存在而导致乙型肝炎的慢性化，因此要想对HBV致病机制有一个清 晰明确的认识，进而寻找出有效的治疗手段，研宄人员迫切需要一种有着完整免疫系统，且 能够模拟人HBV在人体肝脏的感染过程的动物模型。由于小鼠天然不被HBV感染，而目前 所建立的乙肝小鼠模型均未能克服小鼠肝细胞感染HBV这一难题，因而也无法满足HBV研 宄对动物模型的要求。如，人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型能实现HBV的感染复制过程，但 这一模型是基于免疫缺陷的小鼠，因此不能够用于研宄小鼠的免疫反应，而且制作难度大、 成本高、成功率低，难以广泛推广运用。基因转染HBV小鼠模型，制备过程中，HBV进入小 鼠体内会引起宿主的免疫反应，产生针对HBV的细胞免疫和体液免疫，然而由于载体以及 HBV自身的抗原性，以及HBV不能感染小鼠肝细胞，导致HBV只能短暂分泌，不适用于慢性 HBV感染和慢性乙型肝炎的研宄。目前已有的HBV转基因小鼠虽然可以稳定的分泌HBV病 毒及抗原，无需每次进行转染或移植，但由于模型并非通过被HBV感染的途径建立，因此 无法用来进行HBV进入被感染机体和HBV在机体内的散布研宄；另一方面，目前已有的HBV 转基因小鼠对HBV病毒抗原处于免疫耐受状态，机体不能产生对HBV的免疫反应，也不产 生乙型肝炎病变。而且，转基因小鼠的获得需要昂贵的显微注射设备和复杂的操作，非常 耗时费力。以上原因导致了可用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的动物模型的 缺失，客观上限制了对慢性乙型肝炎发病机制、免疫病理、治疗药物以及免疫治疗的相关研 宄。 如何建立一种廉价、操作方便、有着完整免疫系统，能够模拟HBV在人体肝脏的 感染过程的小动物模型以满足HBV研宄所需成为亟待解决的关键问题。 HBV进入肝细胞的门户是病毒的受体。研宄表明，HBV具有严格的宿主易感性和 嗜肝细胞性。感染早期存在于HBV外膜的抗原特定肽段与肝细胞上特异受体识别并结合， 介导病毒进入细胞，启动HBV的复制周期。学者们相继报道了可能起作用的乙型肝炎病毒 受体，如多聚人血清白蛋白，内连接素 II，载脂蛋白H，IL-6,甘油醛三磷酸脱氢酶，中性金 属蛋白酶，人肝细胞附加素等，但直到2012年底仍未确定HBV感染中起决定作用的受体。 最近，我国科学家最新的研宄成果证实了钠离子牛磺胆酸共转运多肽（Na+/ taurocholate Cotransporting Polypeptide，NTCP)是乙型肝炎病毒的关键功能性受体。 NTCP广泛表达于肝细胞基侧膜，是肝细胞中最主要的钠离子依赖性牛磺胆酸吸收系统，也 是肝脏中最重要的胆汁酸吸收系统，在肠肝循环中发挥重要的作用。HBV的Pre-Sl区域特 异识别NTCP，与它结合而感染肝细胞。研宄表明，通过抑制肝细胞内源产生的NTCP，使NTCP 的表达降低，降低了肝细胞中的NTCP的含量，结果极大地减少了 HBV对人和树駒肝细胞的 感染。如果使能感染HBV的H印aRG细胞中NTCP减少，就能降低这些细胞感染HBV。平常不 能感染乙肝病毒的Huh7和H印G2体外培养细胞系，导入NTCP基因后产生相应的蛋白质，这 些细胞就能被HBV所感染。研宄同时表明：尽管NTCP在小鼠、大鼠、树駒、黑猩猩、人等多个 物种中均有表达，且有较高的同源性，但是特定结合域的少数几个氨基酸的不同就能导致 不同物种NTCP对HBV识别及结合能力的巨大差异，这也是HBV宿主范围狭窄的原因之一。 食蟹猴的NTCP通常不能结合乙肝病毒，但实验表明，只要突变其NTCP上一段极小的区域， 使之被人NTCP的相应的氨基酸取代，就能变成有效的HBV受体，介导HBV对食蟹猴肝细胞 的感染。为此，人NTCP被认为是迄今为止发现的最具潜质的乙型肝炎病毒受体，引起了学 者们的极大兴趣和关注，并受到高度评价，这一研宄成果同时也为建立理想的HBV感染模 型带来了宝贵契机。 但是现有技术中至今仍未见报道将人NTCP转入小鼠体内构建表达人NTCP的小鼠 模型的方法，原因可能由于：1. NTCP最近才被证实为乙肝功能性受体，因此尚未有相关模 型小鼠建成的报道；2.动物模型制备中，外源基因的导入形式和导入方法直接影响到外源 基因在动物中的存在和表达。不同的动物模型制备过程中均要经过摸索。对于这一问题， 现有技术还未有有效的解决方案。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏表达人NTCP的小鼠模型， 尤其是缺乏持续、稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人NTCP的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.扩增得到人NTCP基因真核表达框；S2.将人NTCP基因真核表达框通过分子克隆技术插入质粒ZY781的attB和attP位点间，得到携带人NTCP基因真核表达框的微环亲本质粒ZY781‑CMV‑hNTCP；S3.将微环亲本质粒ZY781‑CMV‑hNTCP转入E.coli ZYCY10P3S2T感受态中，筛选阳性克隆，所得阳性克隆经阿拉伯糖诱导重组酶ФC31作用后得到携带人NTCP真核表达框的微环DNApMC‑CMV‑hNTCP；S4.将微环DNA通过水动力转染方法，导入小鼠体内得基因转染小鼠，基因转染小鼠经PCR，组化检测及相关生物学指标的检测后即可作为模型用与相关研究。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀梅，刘光泽，张振伟，孔祥平，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四五八医院，
类型：发明
国别省市：广东;44