解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，该方法包括：样品处理和DNA提取；将与解脲脲原体和微小脲原体拓扑异构酶IV?DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针分别加入两个不同的PCR扩增管中，利用相同的扩增条件同时分别扩增上述两个扩增管中的解脲脲原体和微小脲原体的DNA靶序列；根据检测反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体，并确定其相应含量。对于解脲脲原体和微小脲原体的鉴定和定量分析，本发明专利技术提供的方法具有快速、灵敏、特异性高和成本低的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种荧光定量检测方法，具体涉及ー种。
技术介绍
脲原体(Ureaplasma)是从人体中分离的能自身繁埴的13种支原体之一,属硬壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科脲原体属。脲原体介于病毒和细菌之间，是在人工培养基上能繁殖的最小的原核细胞型微生物，无细胞壁，能自我复制，呈球杆状，大小为125 250nm,分子量为4. 5X IO8,具高度多形性。脲原体根据分子生物学特征分为两个生物群和14个血清型，两个生物群包括微小脲原体(Ureaplasmaparvum, Up)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu), 14个血清型中，基因组较小的血清型1、3、6、14属于微小脲原体，占脲原体感染的90% 92% ;基因组较大的血清型2、4、5、8 13属于解脲脲原体，占脲原体感染的8% 10%。脲原体两个生物型在人群中的分布及致病性存在差异，常用的脲原体血清学分型方法操作比较繁琐，易出现交叉反应，结果难以准确判断。因此，为了克服现有技术的缺点和不足，本专利技术提供ー种操作简便、检测效率高的基因定量分析方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种，利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，可同时对标本中的解脲脲原体和微小脲原体两种基因进行鉴别与定量分析，获得更为准备的 实验结果，该方法对样品需求量少，操作简便，检测效率高。本专利技术通过以下技术方案实现—种，该方法包括以下步骤步骤ー，样本处理和DNA提取；步骤ニ，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入ー个PCR扩增管中；步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另ー个PCR扩增管中；步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列；步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。优选的，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37°C保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。优选的，在所述步骤ニ中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。优选的，在所述步骤ニ中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No. 4所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。优选的，在所述步骤三中，所述正向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。优选的，在所述步骤三中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No. 8所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。优选的,所述突光标记探针为TaqMan探针,所述探针5'端标记有突光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。进ー步优选的，所述荧光报告基团选自FAM、TAT、J0E、R0X、VIC、TAMRA, CY3或CY5，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL或NFQ。本专利技术的有益效果如下一般荧光定量PCR仅检测脲原体，而没有对它们进行分群鉴定。本专利技术通过对脲原体的拓扑异构酶IV A亚单位编码基因(ParC)进行比对，发现解脲脲原体中ParC的部分序列在其10个血清型之间同源性为100 %，但是与微小脲原体的ParC基因序列同源性仅87% ;同样微小脲原体的ParC基因中部分序列在其4个血清型之间同源性为100 %，但与 解脲脲原体序列同源性仅87 %。本专利技术根据解脲脲原体ParC和微小脲原体ParC的该部分序 列 分别合成ー对引物和荧光标记探针，分别置于两个不同的PCR扩增管中，在相同的扩增条件下(包括变性、退火、延伸和循环扩増)对解脲脲原体和微小脲原体分别进行荧光定量PCR扩增。经对比试验和测序分析，该荧光定量PCR检测方法的解脲脲原体扩增和微小脲原体扩增是分开进行的，解脲脲原体和微小脲原体之间无交叉扩增，而且与其它阴道常见病原菌也无交叉扩增，因此具有良好的特异性。经与脲原体培养进行比较，本专利技术的检测敏感性高于培养法。本专利技术操作简便，检测效率高，能够获得准备的实验結果。附图说明图1为用解脲脲原体特异性引物和探针扩增的曲线图。图2为用微小脲原体特异性引物和探针扩增的曲线图。图3为解脲脲原体阳性质控品和阴性质控品的PCR产物电泳图。图4为微小脲原体阳性质控品和阴性质控品的PCR产物电泳图。图5为阴性质控品和其它阴道常见病原菌的PCR产物电泳图。图6为解脲脲原体标准品的扩增曲线图。图7为微小脲原体标准品的扩增曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册■ (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例荧光定量检测解脲脲原体和微小脲原体步骤一，引物和探针的设计与合成引物和探针的序列如序列表所示，引物和探针在对应核苷酸序列表中的位置与扩增产物的长度如表I所不。引物与探针用设计软件设计后合成，引物和探针均为PAGE级纯化。其中微小脲原体探针的5'端标记报告基团FAM，3'端标记淬灭基团TAMRA;解脲脲原体探针的5'端标记报告基团R0X，3'端标记淬灭基团TAMRA。表I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一，样本处理和DNA提取；步骤二，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV?DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入一个PCR扩增管中；步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV?DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另一个PCR扩增管中；步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列；步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。

【技术特征摘要】
2011.09.23 CN 201110287010.41.一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一，样本处理和DNA提取； 步骤ニ，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入ー个PCR扩增管中； 步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另ー个PCR扩增管中； 步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列； 步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。2.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37°C保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。3.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤ニ中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵缜，刘璐，平亚芬，
申请(专利权)人：上海国兴医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：