焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法技术

本发明专利技术提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法，包括以下顺序步骤：步骤1，对KatG基因进行PCR扩增；步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断KatG基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SNP模式、核苷酸加样顺序为GTCACAGTCTG。本发明专利技术提供的检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，无需再做分离培养结核分枝杆菌菌株，相比现在常用检测方法可以缩短检测时间，减少焦磷酸序列测定所需要的反应次数和检测试剂用量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，尤其涉及一种使用焦磷酸测序方法从痰标本中直接检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药突变的引物和检测方法。
技术介绍
异烟肼(NH)作为一种高效特异的抗结核药物，它主要通过结核杆菌内过氧化氢-过氧化物酶(由KatG基因编码)的作用下才能转化为活性形式作用于enoyl-ACP还原酶，抑制杆菌酸和细胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活异烟肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然会造成结核菌异烟肼耐药性，进一步的研究发现造成临床异烟肼耐药性的主要原因不仅是KatG基因的完全缺失、点位突变、碱基的插入和缺失同样重要。目前，前期建立的焦磷酸测序结核杆菌异烟肼耐药性检测方法是从结核分枝杆菌痰标本培养物中进行检测，但结核杆菌分离培养的过程至少需时I月，严重制约了分子生物学检测手段快速的优越性，如果能从痰标本中直接进行耐药性检测，则可以大大缩短药敏结果的时间，对临床指导价值更大。但由于痰标本中所含菌量远远低于痰标本纯培养物，用以前的方法仅进行一轮PCR扩增，所得PCR产物浓度过低，远远达不到焦磷酸测序检测的要求，无法实现在痰标本中的检测。中国专利CN1311435本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤：步骤1，对KatG基因进行PCR扩增；步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断KatG基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SNP模式、核苷酸加样顺序为GTCACAGTCTG。

【技术特征摘要】
1.一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤 步骤I，对KatG基因进行PCR扩增； 步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断KatG基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SNP模式、核苷酸加样顺序为GTCACAGTCTG。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，针对KatG基因315位点进行焦磷酸测序并设计引物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对KatG基因进行PCR扩增进行两次PCR扩增，其中第一次扩增以痰标本结核杆菌DNA提取物为模板，第二次扩增以第一次扩增PCR产物为模板。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或S...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑瑞娟，胡忠义，周燕，王洁，秦莲花，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：