本发明专利技术公开了一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，涉及基因检测盒。一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由10×PCRbuffer2μl；dNTP混合物0.5μl；10μmol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5μl；2U/ul的TaqDNA聚合酶0.5μl；去离子水13μl组成。本发明专利技术对患者血液中提取的DNA组直接对CRYGD基因P23T点突变进行检测，能够精确地诊断结晶样先天性白内障，从而降低漏检率，并能与其他先天性白内障进行鉴别。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测盒，具体涉及一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒。
技术介绍
先天性白内障是胎儿发育过程中晶状体代谢异常导致的不同程度、不同形式的晶状体混浊，不仅使视网膜成像模糊，而且阻止视通路的发育，是目前儿童低视力和致盲的主要病因。该病的发病率约为O. 5%,占儿童致盲性眼病的第二位。先天性白内障致病因素中有1/3与遗传相关，遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁遗传三种类型。致病基因筛查是探索疾病分子发病机制的重要步骤。目前研究发现39个位点、17个基因与先天性白内障相关。包括晶状体蛋白基因，膜蛋白基因即缝隙连接蛋白基因和主要内源性膜蛋白基因，念珠状纤丝蛋白基因，铁蛋白轻链基因以及转录调节因子基因。人晶状体内90%可溶性蛋白为晶状体蛋白，分别为α晶状体蛋白(40%)，β晶状体蛋白(35%)和Y晶状体蛋白(25%)，由三类晶状体蛋白基因α、β、Υ编码。CRYG编码的Y晶状体蛋白在人晶状体中具有较高的浓度和屈光指数，Y晶状体蛋白在晶状体纤维细胞内大量表达并且只表达于己分化的晶状体纤维细胞，而在晶状体上皮细胞内无表达，因此，它对晶状体发育与维持其透明性具有重要作用。Y晶状体蛋白结构较为稳定，其中Y C、Y D、Y S晶状体蛋白分别由CRYGC、CRYGD, CRYGS基因编码。在己知先天性白内障致病侯选基因研究中发现，晶状体蛋白基因突变后不仅能造成晶状体蛋白结构的异常而影响其紧密排列，还会降低晶状体蛋白溶解性而导致混浊的形成。目前已发现几种基因突变，如CRYAB (D140N)与双层板层白内障相关，CRYBB2 (W151C)与中央核性白内障相关，C RYGC (Τ5Ρ)与中央粉尘状白内障相关，CRYGD (R14C)与点状进行性白内障相关，CRYGS (G18V)与多形态皮质性白内障相关。由于遗传性先天性白内障具有非常显著的遗传异质性，不同的基因突变可导致相同表型的白内障，不同表型的白内障可由相同的基因突变造成。导致先天性白内障的临床症状及实验室检测指征具有多样性，因此有必要对白内障的各种临床类型，尤其是尚未发现相关的分子生物学基础的临床类型进行研究，并根据该变异建立起方便、快速和准确的检测方法，用于先天性白内障的诊断。在已知的报道中，结晶样先天性白内障致病基因CRYGD基因第二个外显子中第70位碱基发生C—>A置换改变，导致第23位的脯氨酸改变为苏氨酸(P23T)，使Y晶状体蛋白结构的改变，引起白内障的发生，但是目前还没有较好的方法对其进行定位和检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了对结晶样先天性白内障致病基因CRYGD进行检测，从而提供了一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒。一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由10XPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10 umol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各O. 5ul ；2 U/ul的Taq DNA聚合酶O. 5ul ；去离子水13ul组成。进一步地，所述的正向特异性引物序列为5’ -GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特异性引物序列为:5，-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。上述结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒的使用方法，使用时，将目标基因组DNA 150 ng加入所述的试剂盒中，95°C预变性5 min，95°C变性30 S，55°C退火30 S，72°C延伸10 min，共32个循环，然后将扩增产物在I %琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳lOmin，再按照常规方法检测，即可对结晶样先天性白内障致病基因CRYGD第二个外显子中第70位碱基发生C—>A (P23T)点突变进行定位和检测。进一步地，将扩增产物在2 %琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳20min。本专利技术结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒的检测对象为结晶样先天性白内障致病基因CRYGD，结晶样先天性白内障致病基因CRYGD的序列见序列表，经过100例临床试验，检测准确率高达99. 9%。与现有技术相比，利用本专利技术公开的结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒及其使用方法，对患者血液中提取的DNA组直接对CRYGD基因P23T点突变进行检测，能够精确地诊断结晶样先天性白内障，从而降低漏检率，并能与其他先天性白内障进行鉴别。附图说明图1 :患者眼部检查 表型为晶状体核性结晶样混浊。图2 :收集的家系图，符合常染色体显性遗传；图中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。图3 :D2S325连锁分析图；图中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。图4 :CRYGC和CRYGD附近的微卫星标记D2S2358进行的PAGE图。图5 :家系图及单倍体构建图。图6 =CRYGD基因C70A (P23T)突变序列测序图；图中箭头为错义突变所在位置。图7 =CRYGD基因正常序列测序图；图中箭头为该位置正常序列。图8 =AS-PCR产物凝胶电泳图；M代表DNA分子量Marker，箭头代表患者，其余为正常人，患者同时扩增出227Kb和530bp两个产物，而正常人只有参照产物530bp。具体实施例方式经过山西省眼科医院伦理委员会的批准，在严格遵守赫尔辛基宣言的前提下，本研究收集山西省榆社县一个四代先天性结晶样混浊白内障家系共22例成员，其中患者10例。对家系所有成员进行全面检查，美多丽滴眼液散瞳后经裂隙灯和检眼镜检查确定临床表型，对患者眼部图像进行数码采集。患者眼部检查表型均为晶状体核性结晶样混浊，混浊程度相似，形态一致。患者晶状体内可见点簇状灰白色混浊，中央混浊较为密集，向周边部放散。部分患者伴有继发性外斜视，不合并其他眼部及全身疾病。经受检者知情同意，采集其中17例家系成员的外周静脉血5ml。该家系共有22个家系成员，10名患者。每代都有患者，为垂直遗传，男女皆可患病，符合单基因常染色体显性遗传特点。图1为患者眼部检查表型，为晶状体核性结晶样混浊；图为所收集的家系图，符合常染色体显性遗传，其中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。实施I对致病基因进行染色体定位1、基因组DNA的提取 采用标准饱和酚/氯仿抽提法提取全血基因组DNA。2、连锁分析(I)微卫星标记位点的选择分别选取与17个已知ADCC致病基因距离5Mb范围内的22对多态性微卫星遗传标记，每个ADCC候选基因及其周围微卫星标记的物理距离如表I所/Jn ο表1:17个已知ADCC致病基因及其`附近微卫星标记的物理距离本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，其特征是由AS?PCR扩增检测试剂组成，所述的AS?PCR扩增检测试剂由?10×PCR?buffer?2ul；dNTP混合物0.5ul；10?umol/L的AS?PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5ul；2?U/ul的Taq?DNA?聚合酶0.5ul；去离子水13ul组成。
【技术特征摘要】
1.一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，其特征是由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由IOXPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10umol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各O. 5ul ;2 U/ul的T...
【专利技术属性】
技术研发人员：张素华，张哲，贾亚丁，张晓慧，
申请(专利权)人：山西省眼科医院，
类型：发明
国别省市：
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