检测病源细胞的靶向性分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及检测病源细胞的靶向性分子及其制备方法和应用。本发明专利技术的方法通过对标记物寡聚核苷酸进行信号放大，提高了病源细胞表面特定分子的检测灵敏度；且不同的寡聚核苷酸序列可以对多种待检测分子进行编码，因此可以实现多重检测。

【技术实现步骤摘要】
检测病源细胞的靶向性分子及其应用
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及检测病源细胞的靶向性分子及其制备方法和应用。
技术介绍
众多临床数据和研究表明，对病源细胞的定量检测是准确判断患者病情并给予及时治疗的直接证据。例如，血液中循环肿瘤细胞的数量是决定病人预后的重要因素。同样， 对血液中的疟原虫的检测也是判断疟疾病情的重要指标。传统的检测方法基本是基于对病源细胞表面抗原的检测和定量。在这些方法中， 抗体首先被附着在一个固体载体上，由于抗体-抗原的相互作用抗体和待检测细胞形成复合物。同样的原理，抗体可能先通过抗原-抗体反应和待检细胞形成复合物，然后再附着到一个固体载体上。其后，被抗体抓住的细胞被收集和标记以此来定量。比如免疫荧光技术检测循环肿瘤细胞。首先用附着于磁珠或微流体芯片的抗体将肿瘤细胞从血液中富集出来。 然后用带有标记物、肿瘤细胞特异性的抗体标记肿瘤细胞并进行定量检测。一般来说，标记物包括放射性的同位素，染料，荧光素和酶(用于酶标反应)等。尽管基于抗原捕获的检测方法在临床上应用广泛，但是这些方法有许多不足之处(I)检测灵敏度低。抗原酶标检测主要是通过对细胞抗原直接进行检测。这些方法的检出限受到目标细胞表面抗原数量的限制，检测限通常在 10_9m。因此在细胞数量稀有时(抗原浓度< I(T12M)，灵敏度不够。因此，目前本领域非常有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的灵敏度。(2)通量低。这些方法的通量受限于人工。因此，通量较低，不适用于大量筛查。(3)操作麻烦且人为误差大。传统方法的操作步骤繁复，人工要求高。因此不可避免有很多人为引入的实验误差，从而导致检测结果的可信性下降。(4)多重检测。对样本的多个抗原进行同时检测是临床诊断和治疗分型的重要指导指标。由于标记物的限制，传统的方法最多在同一个检测样本中对病源细胞的3-4个抗原进行同时检测。因此，不可能对样本的抗原进行大规模扫描。现今技术对某种细胞的检测往往基于一个A-B的二联体理念:A代表一个针对细胞的特异性的、高亲和性的配体分子(Kd < 10_6M)，比如单克隆抗体、高亲和性的多肽片段、 高亲和性化学小分子等，用于特异性地结合目标细胞的表面抗原代表一个或多个染料标记分子，用于定量检测分子A。A和B可以是通过化学共价键偶联的分子。例如，抗⑶45 的抗体通过化学键CO-NH和荧光标记分子荧光素琥珀酰亚胺酯键合。此荧光素抗CD45的抗体可以用于特异性的荧光标记并定量检测白细胞。A和B也可以是通过非化学键键合的分子对(如氢键、范德华力等)。比如，A代表生物素共价键偶联的抗CD45的抗体，B代表亲和素共价键偶联的碱性磷酸酶，用于检测和定量。A和白细胞表面的CD45抗原结合，而B 通过生物素和亲和素的氢键结合从而达到检测的目的。上述这些方 法虽然可以很便捷地检测目标细胞，但是这些方法的检出限受到目标细胞表面抗原数量的限制，检测限通常为 IO-9M,灵敏度并不高。因此，目前本领域非常有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供靶向性分子偶联的寡聚核苷酸探针及其制备方法。在本专利技术的第一方面，提供一种检测病源细胞的靶向性分子，结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接(键合)、偶联或偶合的关系。在一个优选例中，X选自特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。在另一优选例中，所述的X对于病源细胞的平衡解离常数小于10_6mOl/L(M)。在另一优选例中，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针是经过化学修饰的寡核苷酸探针，所述的化学修饰增强列寡核苷酸探针的稳定性。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。在另一优选例中，所述的“磷酸键上存在硫代修饰”是指寡核苷酸探针的序列中， P-O发生硫代脱氧而形成P-S。在另一优选例中，所述的“磷酸键上存在硫代修饰”发生在部分磷酸键上或发生在所有磷酸键上。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针是单链或是双链。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的长度是10_150bp (双链)或 10-150nt (单链)；较佳地，所述的寡核苷酸探针的长度是20-100bp (双链)或20_100nt (单链)；更佳地，所述的寡核苷酸探针的长度是20-80bp (双链)或20-80nt (单链)。在本专利技术的另一方面，提供一种制备靶向性分子的方法，所述靶向性分子结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，该结合分子是叶酸-半胱氨酸偶联物；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接(键合)、偶联或偶合的关系；所述方法包括(a)将寡核苷 酸与琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶液混合，将寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯以C-N共价键键合，获得寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物；(b)在寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物中加入叶酸-半胱氨酸偶联物，将叶酸-半胱氨酸的硫基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯上的马来酰亚胺以C-S共价键键合；获得寡核苷酸-叶酸-半胱氨酸产物。在本专利技术的另一方面，提供所述的靶向性分子的用途，用于制备检测病源细胞的试剂或试剂盒。在本专利技术的另一方面，提供一种检测病源细胞的试剂盒，其中包括所述的靶向性分子。在另一优选例中，所述的试剂盒中包括1-100种靶向性分子，各靶向性分子中X相同或不同，且Y的碱基序列不同；从而，当靶向性分子多于一种时，该试剂盒可用于对不同的病源细胞或同一病源细胞表面上不同的特定分子进行多重检测。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括特异性扩增所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的引物；和/或特异性针对所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的检测探针，该检测探针携带可检测标记。在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的中间序列互补。在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的寡核苷酸探针中与引物序列互补的序列位置之外的中间序列位置互补。在另一优选例中，所述的引物的长度是8_50bp ;较佳地是10_30bp。在另一优选例中，所述的检测探针是荧光探针，其携带的可检测标记是荧光分子； 更佳地，所述的检测探针是TaqMan探针。在本专利技术的另一方面，提供一种检测病源细胞的方法，包括(I)将所述的靶向性分子与待测样品共混，孵育；(2)孵育结束后收集细胞，从细胞上洗脱所述的靶向性分子(较佳地，用pH2. 5的甘氨酸缓冲液洗脱)；(3)以步骤(2)洗脱的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，根据定量分析结果获知待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的中间序列互补。在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测病源细胞的靶向性分子，结构如下：X?Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“?”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系。

【技术特征摘要】
1.一种检测病源细胞的靶向性分子，结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系。2.如权利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，X选自特异性靶向病源细胞的抗体、 配体、化学小分子或多肽。3.如权利要求2所述的靶向性分子，其特征在于，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。4.如权利要求3所述的靶向性分子，其特征在于，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。5.如权利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。6.一种制备靶向性分子的方法，所述靶向性分子结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，该结合分子是叶酸-半胱氨酸偶联物；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；所述方法包括(a)将寡核苷酸与琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯溶液混合，将寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯以C-N共价键键合，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：何伟，杨国华，吕娟，韩宁宁，李英辉，郭志伟，
申请(专利权)人：格诺思博生物科技上海有限公司，南通中博医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：